實(shí)驗(yàn)十三酶聯(lián)免疫分析

關(guān)于實(shí)驗(yàn)十三酶聯(lián)免疫分析第1頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月一、ELISA的發(fā)展歷程免疫酶標(biāo)記技術(shù)是繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分析之后發(fā)展起來的一新型血清學(xué)技術(shù)。1966年，Nakane和Avrameas等分別報道用酶代替熒光素標(biāo)記抗體，建立了酶標(biāo)抗體技術(shù)，用于生物組織中抗原的定位和鑒定。1971年，Engvall，VanWeemen等報道了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，從而建立了酶標(biāo)抗體的定量檢測技術(shù)。第2頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月20世紀(jì)80年代，酶標(biāo)記抗體檢測和鑒定蛋白質(zhì)分子的免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)問世。目前，免疫酶標(biāo)記技術(shù)已成為免疫診斷、檢測和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinkedimmunosorbentassay），簡稱ELISA。第3頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月二、ELISA的原理

抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留其酶的活性。第4頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月檢測過程包被封閉受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)加入酶標(biāo)記抗原或抗體加入酶反應(yīng)的底物底物被酶催化成為有色產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量分析第5頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月三、ELISA的類型

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相抗原或抗體，即“免疫吸附劑”；（2）酶標(biāo)記抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”；（3）酶反應(yīng)的底物?？稍O(shè)計出各種不同類型的檢測方法。

第6頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月雙抗體夾心法示意圖固相載體抗體抗原酶抗體酶標(biāo)記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。第7頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月雙抗原夾心法示意圖1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗原，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗原復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。酶抗原酶標(biāo)記抗原抗體抗原固相載體第8頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月酶抗抗體酶標(biāo)記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。間接法示意圖第9頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月捕捉法示意圖酶抗體酶標(biāo)記抗體抗原抗抗體固相載體抗體1.將抗抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體復(fù)合物。3.加入抗原及酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。第10頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月酶標(biāo)抗原競爭法示意圖固相載體抗體抗原酶酶標(biāo)記抗原1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則優(yōu)先競爭結(jié)合抗體，結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.加入酶標(biāo)記抗原，抗原沒有結(jié)合的位點(diǎn)，酶標(biāo)記抗原去占據(jù)，則結(jié)合為酶標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色?？乖?1頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月四、ELISA的試劑ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；3）酶的底物；4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；6）洗滌液；7）酶反應(yīng)終止液第12頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫吸附劑——固相載體

聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯--聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。第13頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月將抗原或抗體固定在固相載體上的過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，依靠兩者的疏水基團(tuán)之間的作用。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可以間接包被，采用捕獲包被法。脂類物質(zhì)，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，待溶劑揮發(fā)，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。包被方式

第15頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。第16頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月包被用抗體取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須純化后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。第17頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月包被的條件

緩沖液：pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2的磷酸鹽緩沖液

pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，需實(shí)驗(yàn)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。第18頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月封閉

封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后續(xù)步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉。第19頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑酶的催化活性抗體（或抗原）的免疫活性含有或少含有游離的抗體（或抗原）結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。第20頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)合物用的抗原和抗體

制備結(jié)合物時，抗原或抗體在與酶聯(lián)結(jié)時，避免有其他雜蛋白的干擾，最好用層析純化的抗體，使全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。第21頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月

酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在ELISA中，HRP，堿性磷酸酶AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。第22頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月底物HRP的底物DH2+H2O2

D+2H2O

上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等。第23頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月鄰苯二胺(OPD)氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。第24頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月五、基本操作注意事項(xiàng)

加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。第25頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。第26頁，課件共28頁，創(chuàng)作于2023年2月洗滌

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也