微生物檢驗(yàn) 3 熒光免疫技術(shù)檢測抗核抗體

PAGEPAGE2人血清中抗核抗體（Anti-nuclearAntibody,ANA）檢測間接免疫熒光法（IFA）【目的】1.掌握IFA原理2.熟悉人血清中抗核抗體的檢測方法.3.了解熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用方法【臨床意義及檢測原理】抗核抗體（ANA）是自身抗體中的一組抗體，指抗細(xì)胞內(nèi)所有抗原成分的自身抗體的總稱。ANA靶抗原分布于整個(gè)細(xì)胞，包括細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞骨架、細(xì)胞分裂周期蛋白等。ANA陽性的疾病很多，最常見于彌漫性結(jié)締組織病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、干燥綜合征（SS）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、硬皮?。⊿Sc）等。在某些非結(jié)締組織病和正常老年人也可以出現(xiàn)低滴度的陽性。ANA檢測在臨床上是一個(gè)極重要的篩選試驗(yàn)，ANA陽性（高滴度）標(biāo)志了自身免疫性疾病的可能性，ANA檢測對風(fēng)濕性疾病的診斷和鑒別具有重要意義。Hep-2（人喉癌上皮細(xì)胞）細(xì)胞核抗原豐富、特異性強(qiáng)、核大、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、易于進(jìn)行結(jié)果觀察及熒光染色核型分析。本實(shí)驗(yàn)以Hep-2細(xì)胞作為抗原，采用間接免疫熒光法，在抗原與病人血清中ANA反應(yīng)后，加入熒光素標(biāo)記的兔抗人IgG抗體，最終在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果?！驹噭?.Hep-2抗原片：人喉癌上皮細(xì)胞待檢血清ANA陽性對照（陽）ANA陰性對照（陰）熒光標(biāo)記二抗（二）洗滌液（PBS-T）、蒸餾水封片劑蓋玻片【器材】1ml、10ul微量移液器、1.5mlEP管、熒光顯微鏡。【操作步驟】2人/組，3個(gè)抗原片3213211.待檢血清的稀釋：用微量移液器吸取洗滌液1000ul于1mlEP管中，再加入待檢血清10ul，即為1:100稀釋液，混勻備用。2.加樣：在倒扣板的反應(yīng)孔內(nèi)分別加入稀釋的待檢血清（1號片）和陰、陽性對照（2,3片），25ul/孔。注意：加樣時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。3.孵育：將抗原片蓋在倒扣板對應(yīng)的凹槽里，室溫孵育30min。注意：確保每個(gè)標(biāo)本均能與抗原基質(zhì)相接觸，而標(biāo)本之間不相互接觸。4.洗滌：取出抗原片，用洗滌液輕輕從一側(cè)將反應(yīng)液洗掉，浸泡在洗片缸內(nèi)，靜置5min后，再用蒸餾水沖洗1次。5.加二抗：在倒扣的反應(yīng)孔內(nèi)加入熒光素標(biāo)記的二抗，25ul/孔。注意：加樣時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。6.孵育：用濾紙擦去抗原片周邊和反面多余的液體后，將抗原片蓋在倒扣板對應(yīng)的凹槽里，室溫孵育30min。注意：確保每個(gè)標(biāo)本均能與抗原基質(zhì)相接觸，而標(biāo)本之間不相互接觸。7.洗滌：同38.封片：在蓋玻片上滴加封片劑。用濾紙擦干抗原片周邊和反面多余液體后，將載片的抗原基質(zhì)朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，完成封片。9.結(jié)果觀察：熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。200倍、400倍鏡下判斷具體核型?！窘Y(jié)果判斷】常見的熒光染色模型有下述6種：均質(zhì)型：胞核熒光均勻一致，分裂期細(xì)胞染色體呈濃集染色。斑點(diǎn)型：胞核內(nèi)熒光呈不同程度的斑點(diǎn)或斑塊狀，核仁有時(shí)陽性。核仁型：核仁染色核膜型：熒光染色集中在核膜邊緣，核中央漸趨暗淡