衛(wèi)生微生物課件第三章 衛(wèi)生微生物學(xué)研究和檢測(cè)方法

第三章

衛(wèi)生微生物學(xué)研究和檢測(cè)方法

1.衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)與醫(yī)學(xué)微生物檢驗(yàn)的區(qū)別與特點(diǎn)?2.樣品的采集原則？3.影響采樣代表性的因素有哪些？4.怎樣使采樣具有針對(duì)性？5.樣品采集后為什么要盡快送檢？6.怎樣保護(hù)樣品中的待檢微生物？7.樣品中抑菌物質(zhì)去除方法有哪些？8.樣品的處理策略（目的）與方法9.怎樣濃縮樣品中的微生物？10.環(huán)境中的微生物數(shù)量低，怎樣提高檢出率？11.怎樣進(jìn)行衛(wèi)生安全性評(píng)價(jià)？第一節(jié)衛(wèi)生微生物學(xué)檢測(cè)特點(diǎn)及基本原則一、衛(wèi)生微生物檢測(cè)的特點(diǎn)

檢測(cè)對(duì)象多致病微生物非致病微生物條件致病微生物檢測(cè)范圍廣標(biāo)本來(lái)源多人：個(gè)體及群體環(huán)境健康相關(guān)產(chǎn)品檢測(cè)目的特殊檢測(cè)方法靈敏濃縮去除不利因素查明突發(fā)公共衛(wèi)生事件的原因（定量測(cè)定和分型檢測(cè)）衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)測(cè)與安全評(píng)價(jià)（衛(wèi)生指示微生物）indicatormicroorganism二、衛(wèi)生微生物檢測(cè)的基本原則

采集保存運(yùn)送檢測(cè)基本原則樣品種類(lèi)感染標(biāo)本正常人體標(biāo)本衛(wèi)生樣品食品、化妝品、水產(chǎn)品、消毒及衛(wèi)生用品、水、土壤、空氣等（一）樣品的采集原則代表性與針對(duì)性采樣部位采樣方法采樣時(shí)間采樣的隨機(jī)性采樣量采樣的注意事項(xiàng)

避免外源性污染避免對(duì)微生物的殺滅作用和引入新的抑菌物質(zhì)注意加入中和劑采樣記錄影響采樣代表性的因素采樣量：采樣部位：采樣時(shí)間：避免對(duì)微生物的殺滅作用和引入新的抑菌物質(zhì)（二）衛(wèi)生樣品的運(yùn)送原則？1.盡快送檢?。。?/p>

多快？一般不超過(guò)3～4h

為什么？減少待測(cè)微生物的死亡。防止微生物的繁殖對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。（二）衛(wèi)生樣品的運(yùn)送原則1.盡快送檢2.注意保護(hù)待檢微生物溫度、加入保護(hù)劑、運(yùn)送培養(yǎng)氧氣、防止溶血3.注意生物安全密封，避免泄露4.完善的樣品交接實(shí)驗(yàn)室收樣應(yīng)按送檢單逐項(xiàng)核對(duì)（三）實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則1、相應(yīng)的硬件條件和設(shè)備2、合格的檢驗(yàn)人員3、標(biāo)準(zhǔn)/公認(rèn)的檢驗(yàn)方法4、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制5、微生物檢驗(yàn)優(yōu)先1、相應(yīng)的硬件條件和設(shè)備微生物危害度分級(jí)致病力、傳染性、當(dāng)?shù)厝巳旱拿庖咚?、有無(wú)免疫制劑和特效治療藥物等危害等級(jí)Ⅰ：低個(gè)體危害，低群體危害危害等級(jí)Ⅱ：中等個(gè)體危害，有限群體危害危害等級(jí)Ⅲ：高個(gè)體危害，低群體危害危害等級(jí)Ⅳ：高個(gè)體危害，高群體危害生物安全防護(hù)水平分級(jí)

生物安全防護(hù)水平(BSL)分級(jí)生物安全防護(hù)水平BSL-1BSL-2BSL-3BSL-4protect

P1P2P3P4實(shí)驗(yàn)室的生物安全防護(hù)

ABSL-1ABSL-2ABSL-3ABSL-41、相應(yīng)的硬件條件和設(shè)備2、具有合格的檢驗(yàn)人員人員的資質(zhì)與培訓(xùn)1、相應(yīng)的硬件條件和設(shè)備2、具有合格的檢驗(yàn)人員3、標(biāo)準(zhǔn)/公認(rèn)的檢驗(yàn)方法GB、規(guī)范等沒(méi)有GB或部頒標(biāo)準(zhǔn)，按上級(jí)CDC要求1、相應(yīng)的硬件條件和設(shè)備2、具有合格的檢驗(yàn)人員3、標(biāo)準(zhǔn)/公認(rèn)的檢驗(yàn)方法4、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制（質(zhì)量保證體系樣品受理部門(mén)樣品檢測(cè)部門(mén)出具檢驗(yàn)報(bào)告的部門(mén)監(jiān)督檢查部門(mén)

第二節(jié)

衛(wèi)生微生物學(xué)研究和檢測(cè)的方法

學(xué)習(xí)內(nèi)容：樣品處理?yè)p傷菌的復(fù)蘇增菌與分離定量計(jì)數(shù)分型鑒定一、樣品處理均質(zhì)化乳化后再行稀釋去除抑菌物質(zhì)濃縮目的菌一、樣品處理（1）均質(zhì)、混勻：液體樣品電動(dòng)混合、手搖混合或敲打、震蕩；固體樣品滅菌乳缽內(nèi)研磨均勻、高速組織搗碎機(jī)或勻漿器；油性樣品乳化+

均質(zhì)為什么要均質(zhì)？有利于取樣的代表性樣品內(nèi)部的待測(cè)微生物釋放但混合的時(shí)間不宜太長(zhǎng)和過(guò)猛？一、樣品處理（1）均質(zhì)化（2）去除抑菌物質(zhì)中和法過(guò)濾法稀釋+過(guò)濾一、樣品處理（1）均質(zhì)化：（2）抑菌物質(zhì)去除（3）濃縮目的菌沉淀離心法過(guò)濾法吸附沉淀法免疫磁珠法

相應(yīng)的抗體連接于磁珠-菌體復(fù)合物二、損傷菌的復(fù)蘇(resuscitation)為什么要復(fù)蘇？受冷、熱、脫水干燥、輻照、高滲透壓或防腐劑、消毒劑的作用，可能引起亞致死性損傷方法

采用無(wú)選擇壓力培養(yǎng)基增菌改變培養(yǎng)溫度、時(shí)間

先在25～37℃修復(fù)12h，在轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基活菌數(shù)測(cè)定時(shí)，降低培養(yǎng)溫度至30～32℃

延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間：48h在選擇性培養(yǎng)基中加入中和劑三、增菌與分離物理方法

高溫或低溫，有氧或無(wú)氧，有或無(wú)光照化學(xué)方法改變鹽的濃度嗜鹽菌培養(yǎng)基7.5%氯化鈉肉湯加入抑菌劑膽鹽、煌綠、多粘菌素B等最常用：選擇性增菌與分離？衛(wèi)生微生物樣品特點(diǎn)：

目的菌數(shù)量低

細(xì)菌受損

雜菌多數(shù)量低——濃縮細(xì)菌受損——復(fù)蘇雜菌多——選擇性增菌和分離四、定量計(jì)數(shù)方法傾注平板計(jì)數(shù)法表面涂布計(jì)數(shù)法MPN法（最可能數(shù)法）比濁計(jì)數(shù)法

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法微菌落快速計(jì)數(shù)法傾注平板計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中細(xì)菌、霉菌和酵母菌等數(shù)量最常用的方法CFU/ml(或g)衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)基本技術(shù)之一稀釋注意事項(xiàng)稀釋、加樣要精確傾注瓊脂培養(yǎng)基溫度約45℃左右混勻2~3個(gè)平行板選擇適宜系數(shù)度計(jì)數(shù)細(xì)菌選擇30~300cfu計(jì)數(shù)霉菌選擇30~100要設(shè)立空白對(duì)照稀釋液+培養(yǎng)基菌落計(jì)算方法（1）菌落計(jì)數(shù)方法肉眼觀查，必要時(shí)用放大鏡檢查，求出各稀釋度的平均菌落總數(shù)。平板菌落數(shù)的選擇一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，計(jì)算平均數(shù)其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，一條鏈，可視為一個(gè)菌落數(shù)稀釋度的選擇應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度若有兩個(gè)稀釋度的菌落數(shù)均在30～300之間，則視兩者之比來(lái)決定比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)若大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)字平均菌落數(shù)均大于300，按稀釋度最高者報(bào)告平均菌落數(shù)均小于30，按稀釋度最低者報(bào)告均無(wú)菌落生長(zhǎng)，以＜1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告均不在30～300之間，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)報(bào)告菌落數(shù)的報(bào)告平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，也可用10的指數(shù)來(lái)表示。表面涂布計(jì)數(shù)法表面涂布計(jì)數(shù)法特點(diǎn)加樣量小可使用不透明培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基成分不耐熱營(yíng)養(yǎng)成分鑒定成分抑菌成分菌落需再進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)可避免因熱瓊脂對(duì)待檢菌的損傷表面涂布計(jì)數(shù)法注意事項(xiàng)涂布要均勻加量不宜過(guò)多MPN法（最可能數(shù)法）10-110-210-3查MPN表MPN法特點(diǎn)半定量法樣品中混有其它細(xì)菌，無(wú)法采用平板菌落計(jì)數(shù)特別適宜對(duì)菌數(shù)少的樣品進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)目前MPN法的應(yīng)用食品中的大腸菌群的計(jì)數(shù)：9管法水中的大腸菌群的計(jì)數(shù)：15管法食品中的金葡菌的計(jì)數(shù)：9管法水中的糞大腸菌群、產(chǎn)氣莢膜梭菌的計(jì)數(shù)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法Breed計(jì)數(shù)法0.01ml菌液計(jì)數(shù)板方格中干燥固定亞甲蘭染色油鏡觀察計(jì)數(shù)

比濁計(jì)數(shù)法原理細(xì)菌懸液的濁度與菌數(shù)成正比方法最常用的標(biāo)準(zhǔn)比濁管是麥?zhǔn)媳葷峁芊止夤舛扔?jì)測(cè)定法準(zhǔn)比濁管及其相應(yīng)菌數(shù)管號(hào)123456789101%BaCl2（ml）0.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01%H2SO4（ml）9.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0相當(dāng)?shù)木鷶?shù)（109/ml）36912151821242730微菌落快速計(jì)數(shù)法加樣0.1～1ml→醋酸纖維素薄膜→培養(yǎng)基襯墊→37℃、5h→取下膜→玻片上加熱干燥→透明液中30sec→貼玻片上→加熱使其完全透明→結(jié)晶紫染色→水洗后低倍鏡下鏡檢→計(jì)數(shù)形成的微菌落→推算標(biāo)本中的微生物數(shù)量。濾膜過(guò)濾法常用于水樣的檢測(cè)五、分型鑒定的方法血清學(xué)分型噬菌體分型細(xì)菌素分型耐藥譜分型質(zhì)粒圖譜分型通過(guò)分析質(zhì)粒的數(shù)量、大小和特征進(jìn)行分型分型和鑒定的基礎(chǔ)是分析質(zhì)粒圖譜。質(zhì)粒指紋圖譜質(zhì)粒酶切圖譜毒素分型

脈沖場(chǎng)凝膠電泳分子分型

六、其他分子生物學(xué)方法PCR核酸雜交G+C含量測(cè)定基因芯片(genechips)蛋白質(zhì)芯片（proteinchips）第三節(jié)衛(wèi)生指示微生物指示微生物定義與分類(lèi)indicatormicroorganism定義：是在常規(guī)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)中，用以指示樣品衛(wèi)生狀況及安全性的微生物。指示微生物分類(lèi)①菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)評(píng)價(jià)被檢樣品的一般衛(wèi)生質(zhì)量、污染程度和安全性②大腸菌群、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等評(píng)價(jià)檢品受人、畜糞便的污染狀況間接反映腸道病原微生物存在的可能性③某些特定環(huán)境不應(yīng)檢出的菌類(lèi)(如特定菌、某些致病菌、或其它指示性微生物)④病毒（包括噬菌體）間接反映腸道病毒存在的可能性。一、指示微生物的選擇（1）總則（選擇標(biāo)準(zhǔn)）數(shù)量大、易檢出檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、方便；有一定的代表性，其數(shù)量變化能反映樣品衛(wèi)生狀況及安全性，即數(shù)量越大，污染越嚴(yán)重，安全性越低。二、指示微生物的選擇（2）糞便污染指示菌的選擇原則①是人及溫血?jiǎng)游锬c道的正常菌群，且數(shù)量大②在外環(huán)境中存活時(shí)間與腸道致病菌大致相似或稍長(zhǎng)③排出體外后，在外環(huán)境中不繁殖④在污染的樣品中易檢出，未污染的樣品中不易檢出⑤對(duì)常用飲用水消毒劑（如氯、臭氧）的抵抗力應(yīng)該不低于或略強(qiáng)于腸道致病菌⑥檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，易于定量計(jì)數(shù)。三、檢測(cè)指示微生物反映樣品衛(wèi)生安全性的原因①致病微生物種類(lèi)繁多，檢測(cè)方法多，不可能分別檢測(cè)各種微生物②分離、鑒定需時(shí)長(zhǎng)，不能滿足實(shí)際需要③分離、鑒定費(fèi)用高，技術(shù)要求高④致病微生物的數(shù)量少，而檢測(cè)方法的靈敏度不高，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。通常以檢測(cè)指示微生物間接反映樣品的安全性四、常用的指示微生物1.菌落總數(shù)2.糞便污染指示菌3.致病菌4.腸道病毒的指標(biāo)微生物

1.菌落總數(shù)定義是指被檢樣品的單位重量(g)、容積(ml)、表面積(cm2)或體積(m3)內(nèi)，所含有的能在某種培養(yǎng)基上經(jīng)一定條件、一定時(shí)間培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落數(shù)量。所得菌落總數(shù)只包括那些能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌，不包括厭氧菌、微需氧菌、嗜冷菌及一些有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的細(xì)菌。1.菌落總數(shù)定義單位：cfu/g、cfu/ml、cfu/cm2

、cfu/m31.菌落總數(shù)定義單位種類(lèi)細(xì)菌菌落總數(shù)霉菌菌落總數(shù)酵母菌菌落總數(shù)1.菌落總數(shù)定義單位種類(lèi)衛(wèi)生意義用于判定檢樣被微生物污染的程度，是某些樣品的衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)。

1.菌落總數(shù)定義單位種類(lèi)衛(wèi)生意義測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)平板傾注法表面涂布法細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)

檢樣（25g或ml）↓做成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液↓選擇2～3個(gè)適宜稀釋度各以1ml分別加入無(wú)菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度兩個(gè)平皿）↓每皿內(nèi)加入適量平板計(jì)數(shù)瓊脂36±1℃↓48±2h菌落計(jì)數(shù)↓報(bào)告平板傾注計(jì)數(shù)稀釋加板、培養(yǎng)計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落總數(shù)檢樣↓做成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液↓選擇2～3個(gè)適宜稀釋度各取0.1ml或適量，置于裝有培養(yǎng)基的平皿中央（每個(gè)稀釋度兩個(gè)平皿）↓用L玻棒遍涂均勻36±1℃↓48±2h菌落計(jì)數(shù)↓報(bào)告表面涂布計(jì)數(shù)法

2.糞便污染指示菌包括大腸菌群、耐熱大腸菌群大腸桿菌糞鏈球菌產(chǎn)氣莢膜梭菌大腸菌群、耐熱大腸菌群大腸菌群（coliformgroup）

定義：是一群能在37℃、24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的、需氧或兼性厭氧的、革蘭陰性的無(wú)芽胞桿菌。主要包括四個(gè)屬埃希菌屬(Escherichae)克雷伯菌屬(Klebsiella)腸桿菌屬(Enterobacter)枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）在44.5℃仍能生長(zhǎng)的大腸菌群大腸桿菌普遍存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)新鮮糞便中可達(dá)109/g若在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，可認(rèn)為被人和動(dòng)物的糞便污染由于大腸桿菌的鑒定方法比較復(fù)雜，用“大腸菌群”代替“大腸桿菌”但近年來(lái)隨著新方法建立，大腸桿菌的應(yīng)用越來(lái)越多如美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EnvironmentalProtectionAgency，EPA）2000年頒布對(duì)大腸桿菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

大腸菌群類(lèi)型及衛(wèi)生意義總大腸菌群37℃生長(zhǎng)的大腸菌群耐熱大腸菌群44.5℃仍能生長(zhǎng)的大腸菌群指示意義：作為被人、畜糞便污染的評(píng)價(jià)指標(biāo)

大腸桿菌＞耐熱大腸桿菌＞總大腸菌群大腸菌群的檢驗(yàn)方法多管發(fā)酵法（最可能數(shù)法，MPN）濾膜法紙片法MPN值的獲得2.查MPN值