流式細(xì)胞儀的原理與應(yīng)用

關(guān)于流式細(xì)胞儀的原理與應(yīng)用PPT第1頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月一簡介

流式細(xì)胞儀(FlowCytometer):是集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM):利用流式細(xì)胞儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)。第2頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細(xì)胞儀的特點單個細(xì)胞或微粒分析同時多參數(shù)分析速度快：10000個細(xì)胞(微粒)/秒統(tǒng)計學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細(xì)胞或微粒第3頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月舉例：細(xì)胞周期分布檢測第4頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月流路(液流系統(tǒng)）流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細(xì)胞懸液5*105~1*106個/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光源濾片電路（檢測系統(tǒng)）光電倍增管PMT放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計（分析系統(tǒng)）計算機二構(gòu)造及工作原理第5頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

流動室是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為430μm×180μm的長方形孔，供細(xì)胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學(xué)特性良好，流速較慢，因而細(xì)胞受照時間長，可收集的細(xì)胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。液流系統(tǒng)第6頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月流動室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系統(tǒng)第7頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月激光光源：目前臺式機FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光(laser)是—種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細(xì)胞快速流動，每個細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為1μs左右，每個細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關(guān)，因此細(xì)胞需要足夠的光照強度。

光學(xué)系統(tǒng)第8頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月信號散射光信號FS細(xì)胞大小SS細(xì)胞顆粒性熒光信號

FL1–FITC

FL2–PE

FL3–ECD

FL4–PC5光學(xué)系統(tǒng)第9頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月散射光信號——細(xì)胞大小及顆粒性FSSS光學(xué)系統(tǒng)第10頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月光路（濾片特性）光學(xué)系統(tǒng)第11頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月流式細(xì)胞儀光路圖Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL光學(xué)系統(tǒng)第12頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月電路電壓調(diào)節(jié)光電倍增管電壓volts增益Gain信號放大方式檢測系統(tǒng)第13頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月電信號輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。細(xì)胞DNA含量、RNA含量等的測量一般選用線性放大測量。在細(xì)胞膜表面抗原等的檢測時，細(xì)胞膜表面抗原的分布有時要相差幾十倍，甚至幾萬倍，通常使用對數(shù)放大器。

檢測系統(tǒng)第14頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月常用熒光染料介紹FITC：綠色525nmPE：橙黃色575nmECD：橙紅色610nmPE－CY5：深紅色675nmPerCP：深紅色675nmPE－CY7：深紅色755nm7AAD：深紅色675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)第15頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月光路補償

FITC/PE/ECD/PC5第16頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月三FCM的數(shù)據(jù)分析單參數(shù)一維直方圖縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)表示相對熒光信號或散色光信號值，單位是道數(shù)。第17頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月2.雙參數(shù)二維點圖顯示來自同一細(xì)胞的兩個參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量間的關(guān)系。橫、縱坐標(biāo)分別表示兩個參數(shù)的相對含量。通過分別計算兩坐標(biāo)所表示參數(shù)的陽性率來得到實驗結(jié)果。第18頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月3.等高線圖4.密度圖第19頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月白血病免疫分型HLA-B27:強直性脊柱炎淋巴細(xì)胞亞群造血干細(xì)胞計數(shù)：造血干細(xì)胞移植網(wǎng)織紅細(xì)胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗1流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用四FCM的應(yīng)用第20頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞大小細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞表面分子：CD系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測：細(xì)胞周期、凋亡2流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用第21頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光信號的定量可以用平均熒光強度（mean值），熒光信號面積（Area，A）來表示。1）蛋白表達的檢測第22頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月2）DNAAnalysisPIEthidiumBromideAcridineOrangeDAPI(UVexcitable)Hoechst33342(viable,UVexcitable)不能主動進入細(xì)胞，需要固定打孔488nm激發(fā)為脂溶性，主動進入細(xì)胞UV激發(fā)常用的DNA染料第23頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisCount2N4NG2MG0G1s第24頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月02004006008001000PIFluorescence2N4NDNAAnalysis第25頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月3）Apoptosis檢測第26頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月A）DNA片斷化檢測細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段第27頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月B）Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。第28頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月C）AnnexinVAssay磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中,Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合第29頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月AnnexinVAssay能夠區(qū)分死亡與凋亡第30頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月D）TUNEL

細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）

第31頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月五實例第32頁，課件共38頁，創(chuàng)作于20