藥物毒理學藥物的安全性評價試驗方法1

第十三章化學致癌作用第一頁，共六十四頁。背部纖維細胞瘤切除的肝腫瘤第二頁，共六十四頁。一、化學致癌作用致癌作用：指導致癌癥的一系列內(nèi)在或外部因素的多步驟過程，包括任何良性或惡性的腫瘤的起源或發(fā)生致癌劑：能在人類或動物引起腫瘤的化學物質(zhì)第三頁，共六十四頁。直接致癌物或初發(fā)致癌原：指未經(jīng)代謝或生物轉(zhuǎn)化就足以激發(fā)致癌效應(yīng)的母體化合物前致癌劑：需要經(jīng)過代謝或生物轉(zhuǎn)化為另一種化合物，才能誘發(fā)致癌作用的化學物質(zhì)輔致癌物質(zhì)：指當與其它致癌劑同時存在時，能增加后者致癌活性的化學物質(zhì)，但其本身并無致癌作用。第四頁，共六十四頁。遺傳毒性致癌物：大多數(shù)化學致癌物進入細胞后與DNA共價結(jié)合，引起基因突變或染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變，最終導致癌變，這類毒物作用靶部位是機體的遺傳物質(zhì)，稱為遺傳毒性致癌物。非遺傳毒性致癌物：通過促進細胞的過度增殖，改變細胞的克隆擴增而發(fā)揮致癌作用的藥物，并不直接作用于遺傳物質(zhì)，因而稱之為非遺傳毒性致癌物。石棉、免疫抑制劑、激素、促癌劑等第五頁，共六十四頁。體細胞突變學說非遺傳毒性致癌作用二、化學致癌機制第六頁，共六十四頁。（1）體細胞突變學說：認為腫瘤的發(fā)生與體細胞突變有關(guān)，即正常細胞在致癌物質(zhì)的作用，其基本遺傳物質(zhì)DNA結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，引起癌變。內(nèi)涵：癌癥是細胞水平的遺傳改變

腫瘤在本質(zhì)上是純系的許多致癌劑或其活性代謝產(chǎn)物與DNA形成共價鍵導致突變受影響的個體基因中某些隱性突變遺傳具有基因組隊癌癥完整的易感性大多數(shù)癌癥顯示染色體畸變腫瘤細胞的顯性特征能通過DNA轉(zhuǎn)染而轉(zhuǎn)移給非腫瘤細胞。第七頁，共六十四頁。化學致癌作用的分子機制癌基因：指一類在自然或?qū)嶒灄l件下具有誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化的潛在基因，它們是化學致癌作用的主要靶分子，在細胞癌變過程中起著關(guān)鍵作用。原癌基因：指機體內(nèi)正常細胞所具有的能致癌的遺傳信息。原癌基因發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化即形成癌基因。抑癌基因：指正常細胞分裂生長的負性調(diào)節(jié)因子，其編碼的蛋白質(zhì)能降低或抑制細胞分裂活性。第八頁，共六十四頁?；瘜W致癌過程引發(fā)階段：化學致癌物對靶細胞DNA產(chǎn)生損傷作用，經(jīng)細胞分裂增殖固定下來，造成少量細胞發(fā)生不可逆的遺傳性改變，成為突變細胞。促長階段：促進引發(fā)形成腫瘤細胞分裂生長的作用階段。進展階段：在腫瘤形成過程中，促進過程中，細胞表現(xiàn)出不可逆的遺傳學改變，其標志為衣穿不穩(wěn)定性增加和惡性變化。第九頁，共六十四頁?；瘜W致癌過程生物化學改變正常DNADNA受損腫瘤DNA腫瘤RNA腫瘤蛋白質(zhì)促癌劑正常DNA修復突變細胞學改變正常細胞腫瘤細胞腫瘤細胞分裂增殖可見的腫瘤致癌因素第十頁，共六十四頁。（2）非遺傳毒性致癌過程化學物對DNA以外的靶點所起的致癌作用成為非遺傳毒性機制，或非突變學說特點：腫瘤促進劑的化學本質(zhì)不具有致癌性。它們并不與DNA結(jié)合，而是通過提供一個選擇生長的有利條件，使得被激發(fā)的純系細胞生長。第十一頁，共六十四頁。三、致癌物的分類遺傳毒性致癌物：直接致癌物：烷化劑、亞硝胺類前致癌物：偶氮化合物、烏拉坦無機致癌物：重金屬非遺傳毒性致癌物:

促癌劑：糖精、巴豆油細胞毒物：氯仿激素：己烯雌酚免疫抑制劑：硫唑嘌呤過氧化物酶體增生劑：三氯乙烯第十二頁，共六十四頁。四、化學致癌活性試驗1、致突變試驗：主要是對致癌物的初步篩選依據(jù)：化學物的致突變性與致癌性具有一定內(nèi)在聯(lián)系缺點：無法檢出非遺傳毒性致癌物（假陰性）和具有遺傳毒性的非致癌物（假陽性）優(yōu)點：可檢出基因遺傳毒性的致癌物（一）短期試驗細菌回復突變試驗果蠅伴性隱性致死試驗染色體畸變試驗微核試驗第十三頁，共六十四頁。2、細胞轉(zhuǎn)化試驗細胞轉(zhuǎn)化：指受試物與正常細胞在體外接觸，如有致癌作用，可使正常細胞形態(tài)、功能發(fā)生變化，發(fā)生與癌細胞相似的過程。觀察終點：惡性變細胞（如細胞的形態(tài)改變、核發(fā)生變化等）優(yōu)點：可檢出遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性致癌物。第十四頁，共六十四頁。3、哺乳動物短期致癌試驗小鼠肺腫瘤誘發(fā)試驗小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗雌性大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗大鼠肝轉(zhuǎn)變灶試驗試驗方法：給予動物受試藥物后，多次持續(xù)給予促長劑，在20~30周左右觀察局部組織（如肺、肝、乳腺、皮膚等）有無腫瘤發(fā)生。第十五頁，共六十四頁。（二）慢性動物試驗1、動物選擇

易感動物

新生動物雌雄各半（一般情況）數(shù)量較多第十六頁，共六十四頁。2、劑量設(shè)計一般設(shè)3個染毒劑量（無作用劑量組、閾劑量組、發(fā)生腫瘤的劑量組）和一個對照組第十七頁，共六十四頁。3、試驗期限與染毒時間長期或終生：試驗周期因不同物種生命周期的不同而有差異。第十八頁，共六十四頁。4、結(jié)果的觀察、分析與評定（1）腫瘤發(fā)生率（2）多發(fā)性（3）潛伏期第十九頁，共六十四頁。（三）流行病學調(diào)查流行病學調(diào)查是判別化學物是否為動物或人類致癌物的唯一手段通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)懷疑動物或人類致癌物，再進行分析性流行病學調(diào)查。第二十頁，共六十四頁。第十四章藥物生殖和發(fā)育毒性作用第二十一頁，共六十四頁。歷史

反應(yīng)停(沙利度胺;

酞胺哌啶酮)

1957–61第二十二頁，共六十四頁。生殖與發(fā)育毒理學是研究毒物對親代的生殖功能及子代發(fā)育過程的有害影響作用。第二十三頁，共六十四頁。生殖毒理學和發(fā)育毒理學常用術(shù)語胚胎毒性:

指在一定劑量下，藥物對胚胎的選擇性毒性作用。

胚胎毒性具體表現(xiàn)：胚胎死亡、生長遲緩、功能發(fā)育不全、畸形母體毒性：指在一定劑量下，藥物僅對懷孕動物產(chǎn)生的選擇性毒性作用。具體表現(xiàn)：母體體重減輕、某些臨床癥狀、死亡第二十四頁，共六十四頁。致畸性：指胚胎在器官發(fā)生期接觸藥物后，能夠引起永久性結(jié)構(gòu)或功能改變而引起畸形的作用。致畸劑：具有致畸性并使出生缺陷發(fā)生率明顯增加的物質(zhì)稱為致畸劑。致畸指數(shù)：指藥物對母體的半數(shù)致死量（LD50）與最小致畸量的比值。第二十五頁，共六十四頁。生殖發(fā)育是哺乳動物繁衍種族的生理過程，其中包含生殖細胞發(fā)生，即精子發(fā)生和卵細胞發(fā)生、配子的釋放、性周期和性行為、卵細胞受精、受精卵的卵裂、胚泡的形成、植入或著床、胚胎形成、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生（或稱器官形成）、胎仔發(fā)育、分娩和哺乳過程。生殖發(fā)育也可稱繁殖過程。哺乳動物的生育繁殖過程

第一節(jié)生殖毒理學第二十六頁，共六十四頁。干擾生殖發(fā)育的任何環(huán)節(jié)，并造成損害作用?？梢酝ㄟ^對內(nèi)分泌系統(tǒng)，特別是對性腺的作用，發(fā)生間接的影響。神經(jīng)系統(tǒng)對內(nèi)分泌功能也有調(diào)節(jié)作用，通過下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸)兩條途徑作用于生殖發(fā)育過程。外源化學物對生殖發(fā)育的影響第二十七頁，共六十四頁。

外源化學物對生殖的過程的損害作用可以表現(xiàn)為不發(fā)情，發(fā)情周期紊亂或各種形式的性功能減退。雌性動物可出現(xiàn)排卵規(guī)律改變，卵巢萎縮，受孕減少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性動物可表現(xiàn)為睪丸萎縮或壞死，精子數(shù)目減少等。

生殖毒性的評價

第二十八頁，共六十四頁。生殖毒性的評價

外源化學物對生殖過程作用的評定主要通過生殖毒性試驗來進行。生殖毒性試驗可以全面反映外源化學物對性腺功能、發(fā)情周期、交配行為、受孕、妊娠過程、分娩、授乳以及幼仔斷乳后生長發(fā)育可能發(fā)生的影響。

第二十九頁，共六十四頁。（一）雄性生殖毒理學雄性生殖毒性學

精子的產(chǎn)生精子輸送神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分泌系統(tǒng)第三十頁，共六十四頁。特定靶位—睪丸內(nèi)環(huán)境

與精子快速生成過程有關(guān)的細胞分裂和代謝活性，對某些類型的損傷特別敏感。藥物特別容易損害DNA或影響快速生長組織需要的細胞蛋白或細胞呼吸。

DNA損害：烷化劑

蛋白質(zhì)損傷：阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春堿等

第三十一頁，共六十四頁。下丘腦-垂體-性腺軸激素調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸

雄激素黃體生成素（LH）促性腺激素釋放激素（GnRH）乙醇、阿片制劑、抗高血壓藥普萘洛爾等第三十二頁，共六十四頁。（二）雌性生殖毒理學

1、卵細胞毒性

阻滯原始卵母細胞，影響進一步的成熟和排卵。如抗癌藥--白消安。2、卵巢體細胞和生殖道毒性卵巢體萎縮—環(huán)氧樹脂、呋喃妥因輸卵管和子宮萎縮—鎘第三十三頁，共六十四頁。3、生殖功能激素調(diào)節(jié)和相關(guān)毒性

下丘腦-垂體-性腺軸促性腺激素釋放激素（GnRH）黃體生成素LH

促卵泡素FSH

雌激素孕激素鉛、林丹等第三十四頁，共六十四頁。第二節(jié)發(fā)育毒理學研究發(fā)育生物體在受精卵、妊娠期、出生后直到性成熟的發(fā)育過程中，由于出生前，接觸導致異常發(fā)育的理化因素或環(huán)境條件后的發(fā)病機制和結(jié)果。第三十五頁，共六十四頁。雙頭小豬臀部結(jié)合第三十六頁，共六十四頁。發(fā)育過程早胚期：容易引起胚胎死亡后胚期（器官發(fā)生期）:關(guān)鍵期胎兒期：生長遲緩、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)機能的改變。圍產(chǎn)期：胎兒發(fā)育的后期和新生兒階段。階段接觸毒物后的后果第三十七頁，共六十四頁。（一）自發(fā)流產(chǎn)和胚胎丟失藥物對早期胚胎發(fā)育毒性最明顯的指標一般，藥物影響早期胚胎的最終結(jié)果呈“全”或“無”模式，即胚胎細胞受到嚴重損傷而不能成活導致流產(chǎn)，若損傷僅涉及小范圍的細胞死亡，則胚胎可完全修復不留任何異常。藥物：抗腫瘤藥、重金屬、中藥（活血化淤藥）第三十八頁，共六十四頁。（二）胚胎毒反應(yīng)先天性缺陷：指出生前任何形態(tài)、生化或功能的異常。致畸劑：指能導致先天性缺陷發(fā)生的化學物質(zhì)藥物：沙立度胺、異維A酸、己烯雌酚、四環(huán)素類、環(huán)磷酰胺等第三十九頁，共六十四頁。第三節(jié)毒性試驗（一）一般毒性試驗：檢測藥物對生殖細胞的發(fā)生和形成是否有影響。

實驗方法：

1、動物：至少一種動物

2、劑量與給藥途徑：高中低三個劑量組臨床用藥途徑

3、給藥時間：交配前

4、對照組：陰性對照、陽性對照

5、觀察與報告：動物的一般狀況、體重變化、受孕率、死胎數(shù)、活胎重量、外觀和內(nèi)臟及骨骼的變化等。三段生殖毒性實驗第四十頁，共六十四頁。（二）致畸胎試驗：確定藥物是否具有胚胎毒性或致畸性。實驗方法：

1、動物：至少一種，首選大鼠

2、劑量與給藥途徑：高中低劑量組臨床給藥途徑

3、給藥時間：胚胎器官形成期內(nèi)連續(xù)給藥

4、對照組：溶劑對照、陽性對照

5、觀察與檢查：紀錄孕鼠重、黃體數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)、活胎重、外觀異常等。

6、報告

7、判定第四十一頁，共六十四頁。（三）圍產(chǎn)期試驗：檢測藥物對胚胎發(fā)育后期、母代分娩過程、哺乳和新生幼仔是否有影響。實驗方法：

1、動物：小鼠或大鼠

2、劑量與給藥途徑：高中低劑量組

臨床給藥途徑

3、給藥時間：大鼠、小鼠于妊娠第15天開始給藥，至分娩后21天（小鼠）和28天（大鼠）

4、對照組：陰性對照、陽性對照

5、觀察與報告：觀察動物一般狀態(tài)、記錄胎仔數(shù)、一般發(fā)育狀況、外觀畸形等第四十二頁，共六十四頁。第十五章藥物遺傳毒性作用一、遺傳改變產(chǎn)生和潛在結(jié)果突變：指有機體遺傳物質(zhì)發(fā)生變化引起遺傳信息的變化，并發(fā)生新的表型效應(yīng)。自發(fā)突變：在自然條件下發(fā)生的突變。誘發(fā)突變：由人工利用物理因素或化學藥劑誘發(fā)的突變稱為誘發(fā)突變。

遺傳毒理學：研究理化因素引起遺傳物質(zhì)（DNA）改變，預(yù)測并防止?jié)撛诘挠泻π?yīng)。第四十三頁，共六十四頁。1、生殖細胞的遺傳損傷危害對后代產(chǎn)生致死性或非致死性的影響。非致死性效應(yīng)表現(xiàn)為后代出現(xiàn)顯性或隱形遺傳性疾病。第四十四頁，共六十四頁。2、體細胞遺傳損傷的危害只影響接觸到該誘變劑的個體。體細胞突變可能與腫瘤、衰老有關(guān)。

第四十五頁，共六十四頁。二、遺傳損傷的類型基因突變：基因中DNA序列的改變?nèi)旧w畸變：染色體結(jié)構(gòu)的改變基因組：突變基因組中染色體數(shù)目的改變。第四十六頁，共六十四頁。堿基改變單鏈斷裂雙鏈斷裂鏈內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)間交聯(lián)DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)無堿基位點鏈間交聯(lián)DNA損傷的常見類型

第四十七頁，共六十四頁。遺傳學終點1983年提出致突變試驗的遺傳學終點分為五類：

DNA完整性的改變

DNA重排或交換DNA堿基序列的改變

染色體完整性的改變

染色體分離改變第四十八頁，共六十四頁。1、第一階段：六個試驗微生物回復突變試驗致突變哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗嚙齒動物微核試驗一般生殖毒性試驗生殖毒性動物致畸胎試驗圍產(chǎn)期毒性試驗

特殊毒性試驗分為三階段第四十九頁，共六十四頁。

2、第二階段：八個試驗

基因突變試驗-2個試驗致突變性染色體畸變試驗-2個試驗

DNA修復試驗-2個試驗動物短期致癌試驗短期致癌試驗哺乳動物培養(yǎng)細胞惡性轉(zhuǎn)化試驗

3、第三階段：動物長期致癌試驗動物長期致癌試驗第五十頁，共六十四頁。三、致突變試驗的方法致突變試驗又稱遺傳毒理學試驗，旨在檢測化學物對生殖細胞和體細胞的致突變性，對遺傳危害性作出初步評價，并預(yù)測其致癌的可能性。第五十一頁，共六十四頁。（一）鼠傷寒沙門氏菌營養(yǎng)缺陷型回復突變試驗

簡稱Ames試驗，用于檢測受試物誘發(fā)大鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株回復突變成野生型的能力。第五十二頁，共六十四頁。原理：利用一組鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株，即一系列組氨酸缺陷型菌株，在加入哺乳動物肝微粒體酶活化的條件下，測定化學物質(zhì)誘導回復突變成野生型菌株的能力。當營養(yǎng)缺陷型細菌回復突變?yōu)橐吧蜁r，細菌不能合成組氨酸到能合成組氨酸，從而能在不加組氨酸的培養(yǎng)基上生長。根據(jù)在不含組氨酸的培養(yǎng)基上生長的細菌集落數(shù)目，與對照組自發(fā)回復突變菌落數(shù)目相比較，來測定化學物質(zhì)誘導微生物基因突變的能力。第五十三頁，共六十四頁。試驗方法菌株：組氨酸缺陷型傷寒沙門氏菌藥物濃度：最高濃度一般為5mg/皿

最低濃度不小于有效濃度或給藥量

一般設(shè)5個以上濃度組代謝活化：應(yīng)用誘導劑處理后的哺乳動物肝微粒體酶（S9）對照：陰性對照、陽性對照、S9平行對照方法：標準平板法或預(yù)培養(yǎng)法，37C，48h觀察結(jié)果。結(jié)果判定：

1、受試藥物所誘發(fā)的回變菌落數(shù)增加，超過對照組2倍，并有劑量依賴性。2、某測試濃度超過陰性對照組2倍以上，結(jié)果具有重復性第五十四頁，共六十四頁。Ames試驗的優(yōu)點：方法靈敏、簡單，檢出率高缺點：微生物的DNA修復系統(tǒng)比哺乳動物簡單，基因不如哺乳動物多，不能完全代表哺乳動物的實際情況。第五十五頁，共六十四頁。（二）哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗1、細胞：中國倉鼠肺細胞系CHL（染色體數(shù)目25），卵巢細胞系CHO（染色體數(shù)目21）

2、濃度設(shè)置：3個濃度組3、代謝活化：采用藥酶誘導劑處理后的哺乳動物肝微粒體酶（S9）進行體外代謝活化試驗4、藥物作用時間：藥物組和細胞接觸非活化組分別作用24h和48h代謝活化組：作用6h以上觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變的試驗第五十六頁，共六十四頁。5、對照：空白對照、溶劑對照、陽性對照和S9對照6、鏡檢：每種濃度至少觀察100個中期分裂相。7、結(jié)果判定

受試物所誘發(fā)的染色體畸變數(shù)目的增加與劑量有關(guān)某一測試點呈現(xiàn)可重復的并有統(tǒng)計學意義的增加第五十七頁，共六十四頁。（三）嚙齒動物微核試驗微核：存在于細胞中主核之外的一種顆粒，大小相當于細胞直徑的1/20~1/5，呈圓形或杏仁狀，其染色與細胞核一致。用于染色體損傷和干擾細胞有絲分裂的化學毒物的快速檢測方法MNNCE第五十八頁，共六十四頁。原理：細胞受到誘變物