酶工程考點總結(jié)

第一章什么是酶？試述酶的化學(xué)本質(zhì)？酶是生物體內(nèi)普遍存在的一種具生物催化活性的蛋白質(zhì)（或核酸）,能在不改變化學(xué)反映平衡點的條件下大大減少反映的活化能,從而使化學(xué)反映可以在常溫常壓下迅速高效地進行.酶促反映速度的概念，表達方法（底物消耗，產(chǎn)物生成），影響酶促反映的因素（至少4種）？酶催化反映的速率稱作酶速度；酶促反映速度就是用一定期間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物生成的量來表達反映的進程。影響酶促反映的因素：pH、溫度、激活劑、克制劑寫出米氏酶促反映動力學(xué)方程并說明其含義.Km值有何物理意義?如何測量Km值和Vmax值?vvo=Vmax[S]Km+[S]Km值物理意義：（1）km是酶的一個基本的特性常數(shù)。其大小與酶的濃度無關(guān)，而與具體的底物有關(guān)，且隨著溫度、pH和離子強度而改變。（2）從km可判斷酶的專一性和天然底物。Km最小的底物，通常就是該酶的最適底物，也就是天然底物。（3）當(dāng)k2＞＞k3時，km的大小可以表達酶與底物的親和性。（4）從km的大小，可以知道對的測定酶活力時所需的底物濃度。（5）km還可以推斷某一代謝物在體內(nèi)也許的代謝途徑。測量Km值和Vmax值的方法：米氏常數(shù)可根據(jù)實驗數(shù)據(jù)作圖法直接求得：先測定不同底物濃度的反映初速度，從v與[S]的關(guān)系曲線求得V，然后再從1/2V求得相應(yīng)的[S]即為Km（近似值）。充足理解酶的不可逆克制,可逆克制(競爭性、非競爭性、反競爭性），理解在上述克制過程中Km和Vmax的變化不可逆克制作用：克制劑與酶的結(jié)合（共價鍵）是不可逆的。通常是與靠近活性部位的氨基酸殘基形成共價鍵，永久地使酶失活。可逆克制作用：克制劑與酶的結(jié)合是可逆的?？酥葡薅仁怯擅概c克制劑之間的親和力大小、克制劑的濃度以及底物的濃度決定。①競爭性克制作用：克制劑和底物競爭與酶結(jié)合。特點：1）克制劑和底物競爭酶的結(jié)合部位2）克制限度取決于I和S的濃度以及與酶結(jié)合的親和力大小。3）競爭性克制劑的結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)十分相似。（第一幅圖）②非競爭性克制作用：底物和克制劑同時與酶結(jié)合，但形成的EIS不能進一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。圖一圖二結(jié)合物質(zhì)代謝過程中舉例說明別構(gòu)酶的概念？有些酶具有類似血紅蛋白那樣的別構(gòu)效應(yīng)，稱為別構(gòu)酶。對的理解酶活性單位的概念。什么是酶的國際單位及其定義？(不能用考馬斯亮藍，由于不能測量目的蛋白的含量)酶活力是指酶催化某一化學(xué)反映的能力。酶（活力）單位：在一定條件下，一定期間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。（U/g，U/ml）國際單位:在最適的反映條件（25℃）下，每分鐘內(nèi)催化一微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定為一個酶活力單位，即1IU=1μ酶的純度的概念及測量酶的純度的方法？酶的純度：單位蛋白中所含的活力單位數(shù)，比活力=活力單位數(shù)/毫克蛋白（氮）酶的純化鑒定：聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法分離提純技術(shù)手段？在酶的分離提純過程中重要技術(shù)指標(biāo)是什么？（理解）純化技術(shù)：凝膠過濾、離子互換、色譜聚焦、疏水作用、親和分離、反相等書本20頁，這題的知識有點散亂，所以大家有愛好在看看，這題答案不擬定酶活性中心,必需氨基酸,反映活化能,單純酶,全酶(結(jié)合酶),輔酶,輔基,單體酶,寡聚酶,多酶復(fù)合體,同工酶,酶原激活酶活性中心：存在于酶分子表面的具有結(jié)合和催化底物形成產(chǎn)物的空間區(qū)域；涉及結(jié)合基團和催化基團。必需基團：這些基團若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失。(必需氨基酸?)必需氨基酸：反映活化能：分子由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)所需的能量。是指在一定溫度下，1mol反映物所有進入活化狀態(tài)所需的自由能。單純酶：全酶：（結(jié)合酶）=酶蛋白+輔因子輔酶：與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機物。輔基：與膜蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機物。單體酶（monomericenzyme)：僅有一條具有活性部位的多肽鏈，所有參與水解反映。寡聚酶(oligomericenzyme)：由幾個或多個亞基組成，亞基牢固地聯(lián)在一起，單個亞基沒有催化活性。亞基之間以非共價鍵結(jié)合。多酶復(fù)合物(multienzymesystem)：幾個酶鑲嵌而成的復(fù)合物。這些酶催化將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的一系列順序反映。同工酶：——能催化相同的化學(xué)反映，但在蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶。酶原的激活：沒有活性的酶的前體稱為酶原。酶原轉(zhuǎn)變成有活性的酶的過程稱為酶原的激活。試述國際酶學(xué)委員會關(guān)于酶的分類及命名的原則,國際酶編號的含義及表述.分幾大類?分6大類：1。氧化還原酶類；2.轉(zhuǎn)移酶；3.水解酶；4.裂合酶；5.異構(gòu)酶；6.連接酶（合成酶）酶的編號(每種酶都有其唯一的獨特的編號,可以看出酶的基本性質(zhì))：統(tǒng)一表達為：(EC數(shù)字1.數(shù)字2.數(shù)字3.數(shù)字4)，其中EC:EnzymeCommission(酶學(xué)委員會)如:乳酸脫氫酶(乳酸:NAD:氧化還原酶(EC1.1.1.27),表達該酶為第一大類(氧化還原酶類),屬其中的第一亞類(作用于CH-OH基團),同時表達該酶屬第一亞-亞類(表達其受體是NAD+或NADP+)第二章固定化酶活力概念（注：限制酶的活動空間，不是固體化）固定化酶的概念：在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶,能連續(xù)地進行反映,反映后的酶可以回收使用.(不一定是固體)固定化：運用一定措施將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進行其特有的催化反映，并可回收及反復(fù)使用的一類技術(shù)。固定化酶與游離酶相比較的優(yōu)勢?固定化酶的優(yōu)勢：①極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；②可以在較長時間內(nèi)進行反復(fù)分批反映和裝柱連續(xù)反映③酶反映過程可以加以嚴格控制；④較游離酶更適合于多酶反映；⑤在大多數(shù)情況下，可以提高酶的穩(wěn)定性；⑥可以增長產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；⑦酶的使用效率提高、成本減少。固定化酶的缺陷：①固定化時，酶的活力有損失；②只能用于可溶性底物，并且較合用于小分子底物，對大分子底物不適宜；③增長了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大；④與完整菌體相比不適宜于多酶反映，特別是需要輔助因子的反映；⑤胞內(nèi)酶必須通過酶的分離手續(xù)評價固定化好壞的指標(biāo)（偶聯(lián)率，相對活力，活力回收，半衰期）偶聯(lián)率，是中間指標(biāo)，表達酶被固定化的限度的高低相對活力，實際體現(xiàn)出的酶活占理論酶活的比例活力回收，終端指標(biāo)，可以體現(xiàn)固定化工藝的好壞。半衰期，是評估固定化酶穩(wěn)定性的指標(biāo)。為什么固定化酶在一般情況下會比游離酶更加穩(wěn)定？固定化后酶分子與載體多點連接，可防止酶分子的伸展變形（空間自由度受限，剛性增長，空間結(jié)構(gòu)不易變----穩(wěn)定）酶活力的緩慢釋放當(dāng)酶與固態(tài)載體結(jié)合后，失去了分子間互相作用的機會，從而克制了酶的降解固定化酶的性質(zhì)發(fā)生變化體現(xiàn)在？米氏常數(shù)Ｋｍ值的變化（見課本Ｐ４４）。性質(zhì)變化體現(xiàn)：酶活力一般都下降，穩(wěn)定性一般上升，最適pH改變（附：最適溫度提高）固定化酶的表觀Ｋｍ隨載體的帶電性能變化：（表觀Km值指的是測出來的Km值,不一定是實際的.比如包埋后的酶也許性質(zhì)不變,但Km會由于傳質(zhì)效應(yīng)而測出來上升,這時由于酶的性質(zhì)不變,事實上km是不變的.）固定化共價固定的活化基團方法舉例?載體上常用的功能基團涉及:芳香氨基,羥基，羧甲基，氨基等可以與載體結(jié)合的酶的功能基團涉及：氨基，羧基，巰基，羥基，咪唑基，酚基等酶的固定化方法重要有：共價結(jié)合固定法，和非共價結(jié)合法。非共價結(jié)合法涉及：結(jié)晶法；分散法；物理吸附法；離子結(jié)合法共價結(jié)合法：重要有二種①將載體有關(guān)基團活化，然后與酶有關(guān)基團發(fā)生偶聯(lián)反映；②在載體上接上一個雙功能基團，然后將酶偶聯(lián)上去。活化載體的方法：重氮偶聯(lián)法;溴化氰法交聯(lián)法屬于共價結(jié)合法，但無載體，最常使用的交聯(lián)劑是：戊二醛。第三章19，化學(xué)修飾:凡通過化學(xué)基團的引入或除去,而使蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾.選擇性化學(xué)修飾:運用化學(xué)試劑對肽鏈特定的基團的專一性修飾,稱為選擇性化學(xué)修飾。親和修飾：修飾劑與底物有相類似的結(jié)構(gòu),對酶活性部位具有高度的專一性,能對活性部位的氨基酸殘基進行共價標(biāo)記,這類專一性化學(xué)修飾稱為親和化學(xué)修飾。親和試劑應(yīng)具有的特性:在使酶不可逆地失活前,親和試劑要和酶形成可逆復(fù)合物;親和試劑的修飾限度是有限的;沒有反映的競爭性配體的存在應(yīng)減弱親和試劑的反映速度;親和試劑的體積不能太大,否則會產(chǎn)生空間障礙;修飾產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定,便于表征和定量.如何控制酶修飾反映的專一性？依賴修飾的目的選擇合適的化學(xué)修飾劑（舉一兩個例子）一般地要考慮以下問題：修飾反映要完畢的限度；對個別氨基酸殘基是否專一；在反映條件下，修飾反映有沒有限度；修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本保持不變；是否需要分離修飾后的衍生物；反映是否需要可逆；是否適合建立快速方便的分析方法。反映條件的選擇（舉一兩個例子）原則：允許修飾反映能順利進行，同時不導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不可逆變性，有助于專一性地修飾蛋白質(zhì)。因此對反映的溫度、pH值、反映介質(zhì)、緩沖液等都要根據(jù)以上原則進行考慮。大分子化學(xué)修飾的優(yōu)點：穩(wěn)定性提高，體內(nèi)半衰期延長，免疫原性和毒性減少或消除，提高膜滲透性，提高療效，增長在有機溶劑中的溶解度和耐有機溶劑變性的能力。舉例分析為什么要進行酶的化學(xué)修飾？適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾是提高酶穩(wěn)定性、解除其抗原性、改變酶學(xué)性質(zhì)（最適pH、最適溫度、Km值、催化活性和專一性）的一種重要手段。簡述酶的重要功能基團的修飾方法,記住每一種功能基團的修飾方法中的典型的一種,特別是有特性性光譜變化的一些基團修飾劑？（重要類型，重要修飾方法和修飾劑）酶修飾的限度和部位的測定？分析方法：光譜法（最簡樸，最有效）；間接法（最常用）修飾對酶的性質(zhì)的影響（是一般，不是一定）？提高生物活性；增強穩(wěn)定性；減少免疫原性；產(chǎn)生新的催化能力。第四章什么叫蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性?如何理解蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性這個概念?影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要因素有哪些?如何理解疏水性與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)系?（疏水鍵內(nèi)部規(guī)則排列越高，穩(wěn)定性越高）蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性:蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響,保持其生物活力的能力.維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要因素:金屬離子、底物、輔因子和其他相對低分子質(zhì)量配體的結(jié)合作用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂的作用鹽橋和氫鍵二硫鍵對氧化修飾敏感的氨基酸含量較低氨基酸殘基的堅實裝配疏水互相作用疏水性與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)系疏水性大小與穩(wěn)定性沒有必然的聯(lián)系非極性氨基酸在蛋白質(zhì)球體內(nèi)的規(guī)則的排列是穩(wěn)定性的因素之一增長疏水作用是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的實用方法:減少蛋白質(zhì)表面的疏水性,增長蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的指標(biāo)?熱穩(wěn)定性的衡量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性的最有效指標(biāo)是什么?（半衰期，熔化溫度，變性劑濃度）指標(biāo)涉及熔化溫度Tm、蛋白質(zhì)自由能、最大穩(wěn)定性溫度、在特定條件下蛋白質(zhì)功能活性維持的時間；其中最有效指標(biāo)Tm、變性劑濃度蛋白質(zhì)失活有哪些也許的因素和機理?蛋白質(zhì)水解酶和自溶作用：體外蛋白水解作用，催化肽鍵水解，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)底物也是蛋白水解酶時就會發(fā)生自我降解現(xiàn)象，即自溶；聚合作用：蛋白質(zhì)一方面發(fā)生可逆性伸展,伸展的蛋白質(zhì)分子彼此締合,以最大限度減少疏水氨基酸暴露于水溶劑,最后也許發(fā)生蛋白質(zhì)分子間二硫鍵的形成,從而使蛋白質(zhì)沉淀析出.蛋白質(zhì)的聚合作用也許是不可逆的,并不一定是不可逆的.極端pH：pH的變化可以引起蛋白質(zhì)的伸展,這個過程原則上是可逆的,但這些變化常能導(dǎo)致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.氧化作用、表面活性和去污劑、變性劑、重金屬離子和巰基試劑、熱、機械力、冷凍和脫水，輻射作用從固定化和修飾的角度討論酶的穩(wěn)定化策略.固定化通過空間障礙，機械方式兩個因素來達成酶的穩(wěn)定化；空間障礙即由于空間障礙可以防止蛋白水解酶的作用，阻擋酶與化學(xué)失活劑的接觸，同時阻礙氧向酶的擴散可以保護對氧不穩(wěn)定的酶。機械方式使酶發(fā)生交聯(lián)或包埋在載體緊密的孔中可以使酶的構(gòu)象更加堅牢，從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過渡。修飾使酶構(gòu)象堅固化，修飾可增長、中和或改變酶分子上的帶電殘基，可溶性大分子的連接克制與其他溶質(zhì)（蛋白酶）的互相作用，從而達成酶的穩(wěn)定化。第五章27，有機溶劑中酶的催化活性和選擇性與什么因素有關(guān)?(至少指出4種因素)系統(tǒng)的含水量、有機溶劑性質(zhì)、酶的狀態(tài)（固定化、游離、化學(xué)修飾、干粉等）、環(huán)境pH值等密切相關(guān)酶在非水介質(zhì)中酶結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)系如何變化?答：酶的結(jié)構(gòu)的改變使酶功能發(fā)生相應(yīng)的改變。①酶分子結(jié)構(gòu)動態(tài)變化：酶分子在水溶液中以其緊密的空間結(jié)構(gòu)和一定的柔性發(fā)揮催化功能；在含微量水（<1%）的有機溶劑中,與蛋白質(zhì)分子形成分子間氫鍵的水很少,蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵起主導(dǎo)作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變得“剛硬”，活動的自由度變小，限制了疏水環(huán)境下蛋白質(zhì)構(gòu)象向熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)的變化。導(dǎo)致：酶的活力發(fā)生改變：一般可以較好的保持，但部分酶會失活②由于有機溶劑中缺少使酶失活的水分子,由水引起的酶分子中天冬酰胺脫氨基作用,天冬氨酸肽鍵水解,二硫鍵破壞,半胱氨酸氧化及脯氨酸和甘氨酸的異構(gòu)化等蛋白質(zhì)熱失活過程全都難以進行導(dǎo)致：有機溶劑中酶的熱穩(wěn)定性和儲存性都比水溶液中高。③酶在有機溶劑中對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)均有嚴格的選擇性;酶與底物的結(jié)合受溶劑的影響,底物專一性在有機溶劑中將發(fā)生改變；在水中酶和底物重要靠疏水作用,而在非水介質(zhì)中疏水作用已不重要.重要決定于自由能的變化導(dǎo)致：對生產(chǎn)有利的改變，如底物特異性提高28，酶在有機介質(zhì)中具有更高穩(wěn)定性的因素?答：由于有機溶劑中缺少使酶失活的水分子,由水引起的酶分子中天冬酰胺脫氨基作用,天冬氨酸肽鍵水解,二硫鍵破壞,半胱氨酸氧化及脯氨酸和甘氨酸的異構(gòu)化等蛋白質(zhì)熱失活過程全都難以進行29，酶在有機溶劑中表現(xiàn)催化作用與水的關(guān)系?答：①與酶結(jié)合的水量是影響酶活力穩(wěn)定性以及專一性的決定因素,成功應(yīng)用非水介質(zhì)中的酶催化反映,控制酶結(jié)合水和水在酶分子中的位置是關(guān)鍵.②水對于酶催化活性構(gòu)象的獲得是必須的,但水也與許多酶的失活過程有關(guān).③在非水酶體系中,含水量的微小差別會導(dǎo)致酶催化活性的較大改變.具體細化：（④當(dāng)酶周邊的水化層受到破壞時,酶基本上是沒有活力的,隨著水化限度的增長,酶活力將得到恢復(fù).⑤酶需要水維持其活性三維結(jié)構(gòu),水影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性,活性位點的極性和穩(wěn)定性;酶周邊水的存在,能減少酶分子的極性氨基酸的互相作用,防止產(chǎn)生不對的的構(gòu)象.⑥含水量太高時,酶結(jié)構(gòu)的柔性過大,酶的構(gòu)象將向疏水環(huán)境熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)變化,引起酶結(jié)構(gòu)的改變和失活.）30，非水介質(zhì)中酶的催化作用與溶劑的關(guān)系?答：①有機溶劑對酶的動態(tài)的影響有機溶劑通過改變蛋白分子的動態(tài)移動性及構(gòu)象來影響酶的活力。②溶劑對酶的結(jié)構(gòu)的影響在有機溶劑中，酶的整體性和活性中心的結(jié)構(gòu)都保持完整，但酶分子自身的動態(tài)結(jié)構(gòu)姐表面發(fā)生不可忽視的變化。③溶劑對酶活性中心的影響溶劑會減少整個活性中心的數(shù)量。④酶活性和溶劑的屬性存在定量關(guān)系⑤溶劑的幾何形狀也影響非水介質(zhì)中酶的活性31，酶在非水介質(zhì)中重要酶學(xué)性質(zhì)的變化答：①酶的催化活性和穩(wěn)定性酶分子結(jié)構(gòu)動態(tài)變化，即蛋白質(zhì)的剛性變強，活動自由度變小導(dǎo)致酶活力的變化。而在非水介質(zhì)中有水引起的酶分子中天冬氨酰脫氨作用等蛋白質(zhì)熱時候的過程難以進行，以及蛋白酶在非水介質(zhì)的缺少致使其穩(wěn)定性增強。②酶催化的選擇性底物特異性，對映體的選擇性，位置選擇性，化學(xué)鍵選擇性等發(fā)生改變③微水有機溶劑中酶催化的動力學(xué)非水介質(zhì)中酶催化的動力學(xué)中催化機制，米氏常數(shù)等不同于水相中酶動力學(xué)④非水相酶催化的其他性質(zhì)酶在有機溶劑中存在“分子記憶”效應(yīng)32，最適水量,pH記憶與pH忘掉最適水量:是保證酶的極性部位水合,表現(xiàn)活力必須的,也叫必需水.有機溶劑中的酶可以記憶它冷凍干燥或丙酮沉淀前所在緩沖液中的pH,這種現(xiàn)象被稱為酶的pH記憶.微水有機溶劑中疏水性的酸或堿與它們的鹽組成的混合物,可以作為有機相緩沖液,這兩種形式的比例控制著有機相中酶的解離狀態(tài),使酶完全忘掉干燥前它所處的水溶液的pH值,這種現(xiàn)象叫pH忘掉第六章概念：人工酶：又稱模擬酶模型，它是吸取酶中那些起主導(dǎo)作用的因素，運用有機化學(xué)、生物化學(xué)等方法設(shè)計和合成一些較天然酶簡樸的非蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子，以這些分子作為模型來模擬酶對其作用底物的結(jié)合和催化過程酶的人工模擬分子印跡分子印跡(molecularimprinting):制備對某一化合物具有選擇性的聚合物的過程.這個分子叫印跡分子(printmolecule,P),也叫模板分子(template,T).分子印跡酶運用分子印跡技術(shù)制備能與底物特異性結(jié)合并具有一定的催化能力的聚合物叫分子印跡酶,是模擬酶的一種第七章：39，抗體酶：本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白40，理解抗體和抗體酶以及抗體酶和一般蛋白酶的不同？（例如前者底物結(jié)合方式，后者基態(tài)和過渡態(tài)的區(qū)別）①酶和抗體的本質(zhì)區(qū)別就在于：酶是能與底物的反映過渡態(tài)選擇結(jié)合的催化性物質(zhì)，而抗體是和底物的基態(tài)分子緊密結(jié)合的物質(zhì)。抗體酶與蛋白酶的異同：同：同是蛋白質(zhì)，選擇性結(jié)合底物，催化效率高，專一性，可以進行