測(cè)定胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)的方案

標(biāo)題：測(cè)定胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)的方案姓名:學(xué)號(hào):院系:專業(yè):提交時(shí)間：2012年11月19日星期一摘要： 研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系是目前分子生物學(xué)的重大課題之一，1953年，英國生物化學(xué)家FredSanger報(bào)道了胰島素(insulin)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，同年，Watson與Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。1969年，基本與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)規(guī)定以各種氨基酸按一定順序排列構(gòu)成的蛋白質(zhì)肽鏈骨架為蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)。測(cè)定蛋白質(zhì)(胰島素)結(jié)構(gòu)，主要要測(cè)定出：多肽鏈的數(shù)目；每條多肽鏈末端氨基酸的種類；每條肽鏈上氨基酸的種類，數(shù)目及連接順序；鏈內(nèi)于連間二硫鍵的數(shù)目與位置。至此，一種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)已基本明確。關(guān)鍵字： 胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法化學(xué)法與酶解法1953年，英國生物化學(xué)家FredSanger報(bào)道了胰島素（insulin）的一級(jí)結(jié)構(gòu)，這是世界上第一個(gè)被確定一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。同年，Watson與Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。生物化學(xué)由此邁向了一個(gè)更高層次一一分子生物學(xué)時(shí)代。胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)由51個(gè)氨基酸殘基組成分兩條鏈：A鏈：21個(gè)氨基酸殘基B鏈：30個(gè)氨基酸殘基含三個(gè)二硫鏈：一個(gè)A鏈內(nèi)的二硫兩個(gè)鏈間二硫鍵fryHe|al CHftin■fluGin-Cys-r-5er-lie^Gys-Ser-L^j-T^r-Gin-Leu-GLi-AsivTyr-C-y^-Asn早I ty5-Giy-Ser-nis-Leu-Vai-Giu-Aia-Lej-Tyr-GlyCHAINBAsnvaiAsnvaiArgThr-L^APr—Thr-Tyr-PFi卜Ph卜GlyHUMANINSULIN.胰島素的功能:胰島素是由胰島0細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)類激素促進(jìn)肌肉、脂肪組織細(xì)胞膜對(duì)葡萄糖的通透性?誘導(dǎo)、促進(jìn)肝臟葡萄糖激酶等合成，增強(qiáng)糖的分解代謝?促進(jìn)肝、肌肉中糖原合成?抑制糖異生?促進(jìn)糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹?抑制脂肪分解人與各種動(dòng)物胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)比較表：一些哺乳動(dòng)物胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異名稱A8A9A10B30與人的差異數(shù)活性人蘇氨酸絲氨酸異亮氨酸蘇氨酸-豬--丙氨酸1抹香鯨--丙氨酸1馬-甘氨酸丙氨酸21象-甘氨酸纈氨酸21牛丙氨酸-纈氨酸丙氨酸31蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，概括起來包含多肽鏈的分離、降解、肽段的分離和順序分析以及一S—S—定位等。多肽鏈的分離在測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以前，首先必須保證被測(cè)蛋白質(zhì)的純度，使結(jié)果準(zhǔn)確可靠。其次要了解它的分子量和亞基數(shù)，按照其亞基數(shù)將蛋白質(zhì)分成幾個(gè)多肽鏈。肽鏈的拆開胰島素分子多肽鏈的連接有共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合兩種。要拆開以共價(jià)結(jié)合的-S-S-連接的多肽鏈，采用的方法：巰基乙醇還原：利用還原劑疏基乙醇亦可使蛋白質(zhì)的-S-S-斷裂。當(dāng)高濃度的疏基乙醇在pH8條件下室溫保溫幾小時(shí)后，可以使-S-S-定量還原為垂H。與此同時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)中還需要有8摩爾脲或6摩爾鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性，多肽鏈松散成為無規(guī)則的構(gòu)型，此時(shí)還原劑就可作用于-S-S-。此反應(yīng)是可逆的，因此要使反應(yīng)完全，疏基乙醇的濃度必需在0.1-0.5摩爾。末端分析(1)N-末端測(cè)定：二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等報(bào)告了一種測(cè)定N-末端的靈敏方法，采用1-二甲基氨基荼-5-磺酰氯，簡(jiǎn)稱丹磺酰氯。它與游離氨基末端作用，方法類似于Sanger的DNFB法（二硝基氟苯法（FDNB,DNFB）:1945年Sanger提出此方法，是他的重要貢獻(xiàn)之一。DNP-氨基酸用有機(jī)溶劑抽提后，通過層析位置可鑒定它是何種氨基酸。Sanger用此方法測(cè)定了胰島素的N末端分別為甘氨酸及苯丙氨酸。），產(chǎn)物是磺酰胺衍生物。丹磺酰鏈酸具有強(qiáng)烈的黃色熒光。此法優(yōu)點(diǎn)為靈敏性較高（比FDNB法提高100倍，樣品量小于1毫微克分子）及丹磺酰氨基酸穩(wěn)定性較高（對(duì)酸水解穩(wěn)定性較DNP氨基酸高），可用紙電泳或聚酰胺薄膜層析鑒定。（2）C-末端分析：肼解法：這是測(cè)定C-末端最常用的方法。將多肽溶于無水肼中，100°C下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果羧基末端氨基酸以游離氨基酸狀釋放，而其余肽鏈部分與肼生成氨基酸肼。這樣羧基末端氨基酸可以采用抽提或離子交換層析的方法將其分出而進(jìn)行分析。如果羧基末端氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)菐в絮０啡缣於０泛凸劝滨０?，則肼解時(shí)不能產(chǎn)生游離的羧基末端氨基酸。此外肼解時(shí)注意避免任何少量的水解，以免釋出的氨基酸混淆末端分析。3）氨基酸組成分析在進(jìn)一步分析多肽鏈的氨基酸順序之前，首先應(yīng)了解它是由那幾種氨基酸組成的，每種氨基酸有多少?分析組成的方法有：離子交換層析法：Spaekman等發(fā)展了一種精確的氨基酸組分的定量方法。他們采用磺酸型的離子交換樹脂，這是一種高分子量的固體聚苯乙烯，帶有大量的功能基團(tuán)，磺酸基在低pH和低離子強(qiáng)度條件下，根據(jù)氨基酸的酸堿性，氨基酸帶正電，于是替換下樹脂上的Na+，借助靜電作用而結(jié)合到磺酸基上。由于各種氨基酸在樹脂上的親和力不同，因此當(dāng)改變?nèi)芤簆H和離子強(qiáng)度，便可依次將它們洗脫下來而分開，并進(jìn)行定量測(cè)定。在此基礎(chǔ)上發(fā)展了氨基酸自動(dòng)分析儀。隨著科學(xué)技術(shù)的日益進(jìn)展，氨基酸自動(dòng)分析儀在樣品的用量，分離速度及檢測(cè)能力上也有了很大的提高。目前最好的儀器樣品分析量只要幾十Picomole,分析時(shí)間只要數(shù)十分鐘，而且計(jì)算全部自動(dòng)化，給研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)帶來了極大的方便。多肽鏈的降解多肽鏈的氨基酸組成往往是比較復(fù)雜，因此直接分析多肽的氨基酸順序還是很困難的，多采用將多肽鏈進(jìn)一步降解成為更小的片段，然后再行分析。肽鍵的裂解是一級(jí)結(jié)構(gòu)研究工作中的重要問題，它要求裂解點(diǎn)少，選擇性強(qiáng)，而且反應(yīng)產(chǎn)率高，目前主要有化學(xué)法和酶解法兩類?；瘜W(xué)法溴化氤法：是最理想的化學(xué)方法，能選擇性斷裂甲硫氨酸所在的肽鍵.漠化氫化學(xué)降解法其優(yōu)點(diǎn)：一般蛋白質(zhì)含甲硫氨酸較少，由此可獲得大片段;專一性強(qiáng)；產(chǎn)率高達(dá)80%以上；作用條件溫和，在室溫中用幾到十幾小時(shí)即可。肽段的分離大部分肽段的分離主要通過凝膠過濾法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有機(jī)溶劑使之溶解。肽的順序分析酶解法:分析肽段也可采用酶解法，利用專一性不同的兩種酶將一個(gè)肽分別斷裂成更小的寡肽，比較兩種方法所得之肽段的重復(fù)性，進(jìn)行氨基酸順序的裝配。例如，有一個(gè)肽段，通過氨基酸組成分析已知其為十肽，假如先以糜蛋白酶水解，則得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。分析結(jié)果如下：Ala?Phe+Gly?Lys?Asn?Tyr+Arg?Trp+His?Val糜蛋白酶水解+肽(Ala?Phe?Gly?Lys?Asn?Tyr?Arg?Trp?His?Val)胰蛋白酶水解Ala?Phe?Gly?Lys+Asa?Tyr?Arg+Trp?His?Val將此兩套寡肽可以做分析比較，因?yàn)槭牡腘末端及C末端已事先測(cè)定分別為Ala及Val，因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此類推如下寡肽號(hào)氨基酸組成部分順序A-1Ala?PhaB-1Ala?Phe?Gly?LysA-2Gly?Lys?Asn?TyrB-2Asn?Tyr?ArgA-3Arg?TrpB-3Trp?His?ValA-4His?Val+肽順序Ala?Phe?Gly?Lys?Asn?Tyr?Arg?Trp?His?Val5.二硫鍵定位蛋白質(zhì)分子不經(jīng)任何處理，直接用酶水解，檢出其中二硫鍵的肽段，然后將二硫鍵拆開，分別測(cè)定兩個(gè)肽的順序，將此兩肽結(jié)構(gòu)與測(cè)出的一級(jí)結(jié)構(gòu)比較，就能找出相應(yīng)的二硫鍵的位用酶直接水解變形的蛋白質(zhì)：由于二硫鍵只在偏酸性條件下才穩(wěn)定存在，（在堿性條件下易發(fā)生交換），因此常用胃蛋白酶水解，且此酶專一性低，位點(diǎn)多，生成的肽段中包含二硫