發(fā)酵分析高效液相色譜技術(shù)

高效液相色譜法它是在經(jīng)典液相色譜實驗基礎(chǔ)上，引入氣相色譜的理論。以液體作為流動相的色譜法。在技術(shù)上采用高壓輸液泵，高效固定相和高靈敏的檢測器，而發(fā)展起來的快速分離分析技術(shù)。目前一頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點HPLC和經(jīng)典液相色譜法的比較

高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法色譜柱柱長/cm10～2510～200色譜柱柱內(nèi)徑/mm2～10（不銹鋼管）10～50（玻璃管）固定相粒度（粒徑μm）3～5075～600流動相流動方式高壓輸液泵壓入靠重力流入溶液的傳質(zhì)、擴(kuò)散速度快緩慢色譜柱入口壓力/MPa2～200.001～0.1色譜柱柱效/（理論塔板數(shù)/m）2*103～5*1042～50進(jìn)樣量/（g）10-6～10-21～10分析時間/h0.05～1.01～20目前二頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點HPLCvsGC分析對象流動相工作條件氣相色譜法氣體和沸點較低的化合物，僅占有機物總數(shù)的20％

惰性氣體溫度較高高效液相色譜法高極性、高分子量、離子型的物質(zhì)，占有機物總數(shù)近80％

液體可在室溫下工作目前三頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點

特點：高壓、高效、高速、高靈敏高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。LC＜＞GC互補性目前四頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點高效液相色譜法的特點（1）分離效能高：柱效可達(dá)5000~30000塊/米（2）選擇性高：通過流動相的控制來改善分離過程的選擇性（3）檢測靈敏度高：UV—最小檢出量可以達(dá)到10-9g

FD--最小檢出量可以達(dá)到10-12g（4）分析速度快:采用了高壓泵目前五頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點HPLC液-固吸附液-液分配正相色譜反相色譜一般反相色譜離子對色譜離子抑制色譜離子交換色譜一般離子交換色譜離子色譜氨基酸分析空間排斥色譜凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜假相色譜膠束色譜環(huán)糊精色譜親合色譜，手性色譜，毛細(xì)管電泳目前六頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點結(jié)構(gòu)流程高效液相色譜儀目前七頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點高壓輸液系統(tǒng)：儲液罐、吸濾器、高壓輸液泵、脫氣裝置及梯度洗脫裝置進(jìn)樣系統(tǒng)：進(jìn)樣器，進(jìn)樣閥分離系統(tǒng)：色譜柱，恒溫箱檢測系統(tǒng)：檢測器記錄系統(tǒng)：記錄裝置、色譜工作站目前八頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點色譜柱進(jìn)樣閥流動相檢測器高壓泵脫氣裝置目前九頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點1、流動相和儲液罐（1）儲液罐

材質(zhì)：玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮（PEEK）

棕色玻璃瓶會避免藻類的生長

容積：0.5~2.0L

放置位置：高于泵體，保持一定的輸液靜壓差

注意：密封、過濾

一、高壓輸液系統(tǒng)目前十頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點液相色譜的流動相1.流動相特性（1）流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，正相，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液相色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。目前十一頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點正相色譜反相色譜時間時間時間正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系待測物極性：A>B>C目前十二頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點2.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。目前十三頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點3.流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。

常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)目前十四頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點避免使用對不銹鋼有腐蝕性的溶劑。例：硝酸、硫酸、鹽酸、鹵化物，四氯化碳與異丙醇或四氫呋喃的混合物，含強絡(luò)合劑的溶液等。過濾——用濾膜過濾或垂熔漏斗過濾脫氣——采用超聲或過濾的方法注意流動相使用前沖洗使用含酸、堿、緩沖液的流動相后，必須用不含鹽的有機溶劑-水沖洗！目前十五頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點（2）流動相----過濾流動相過濾的目的

過濾去除可能存在的微小固體顆粒

保護(hù)色譜高壓泵和色譜柱流動相過濾方法

在線溶劑過濾抽真空過濾目前十六頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點溶劑吸濾器:Ni合金，孔約0.45

m，防止顆粒物進(jìn)行泵內(nèi)。目前十七頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點流動相在線過濾：

清潔方法：1、用水沖洗殘留溶劑后，將過濾器放在約35％濃硝酸里浸一小時2、用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器3、將過濾器重新裝好。4、定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶（每1～3個月至少清洗一次）不能用超聲波清洗目前十八頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點流動相抽真空過濾過濾用膜：水系和有機，孔徑：0.22μm和0.45μm目前十九頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化（2）流動相----脫氣目前二十頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點常用的脫氣方法有：抽真空脫氣法：特點：可以一次完成過濾和脫氣任務(wù)注意：抽真空會引起混合溶劑組分的變化，適合單一溶劑體系超聲波脫氣法簡單，但效果不理想目前二十一頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點使用新鮮配制的流動相，特別是水溶劑或鹽緩沖液建議不超過兩天，最好每天更換流動相：water/methanol/trifluoroaceticacid(50/50/0.1)a:freshb:afterthreehoursc:aftereighthours目前二十二頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2、高壓泵目前二十三頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點活塞型往復(fù)泵——液相色譜儀中使用最廣泛的恒流泵目前二十四頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點目前二十五頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點目前二十六頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點目前二十七頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵示意圖目前二十八頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點3、梯度洗脫裝置：為什么要進(jìn)行梯度洗脫？使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離梯度洗脫：在分離過程中逐漸改變流動相組成，如溶劑的極性、離子強度、pH值等。目前二十九頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點梯度洗脫裝置

梯度洗脫技術(shù)可以提高柱效、縮短分析時間，改善檢測器的靈敏度，它類似于GC種使用的程序升溫技術(shù)

影響梯度洗脫的主要因素有：溶劑的純度、溶劑的互溶性、檢測器的種類

目前三十頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點高壓梯度：用于二元梯度，用兩個泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩溶液至混合器

目前三十一頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點低壓梯度：只用一個高壓泵，在泵前安裝了一個比例閥，混合就在比例閥中完成。

目前三十二頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點四元低壓梯度系統(tǒng)目前三十三頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點四元高壓梯度系統(tǒng)目前三十四頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點泵壓力不正常的主要原因：

氣泡，主動閥故障，出口閥故障，密封墊或柱塞桿磨損，滲漏或堵塞，比例閥故障，傳感器故障，使用比例閥混合時鹽濃度太高

目前三十五頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點二、進(jìn)樣裝置六通閥進(jìn)樣裝置目前三十六頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點目前三十七頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點六通閥進(jìn)樣裝置正面目前三十八頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點一定不能使用尖針！它會嚴(yán)重刮壞轉(zhuǎn)子墊圈進(jìn)樣針目前三十九頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點六通閥進(jìn)樣裝置反面連接目前四十頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點自動進(jìn)樣器樣品瓶置于進(jìn)樣針下方目前四十一頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點進(jìn)樣針穿過墊圈進(jìn)入瓶中目前四十二頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點注射器抽取所設(shè)定的樣品體積目前四十三頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點進(jìn)樣針收回目前四十四頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點轉(zhuǎn)入針端口使之并成為流路的一部分目前四十五頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點進(jìn)樣注意點進(jìn)樣閥的廢液出口端高度必須與進(jìn)樣針在同一水平位置，以免虹吸作用，使樣品向針筒方向回流，或從廢液口流出。使用前后，要用流動相（不含酸堿等緩沖液）或甲醇或水沖洗針孔，用針孔清洗器）。目前四十六頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點進(jìn)樣方法整個定量圈體積進(jìn)樣——為獲得好的精密度，進(jìn)樣量應(yīng)大于定量圈量的2-5倍以上。由于層流影響，需要有過量的樣品液來取代管壁上的流動相。SampleMobilephase目前四十七頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點例20l定量圈，進(jìn)樣體積不能超過10l。否則，部分樣品將會從出口流失。這是因為由于層流的關(guān)系，樣品流經(jīng)管中心的速度是平均速度的兩倍。進(jìn)樣前應(yīng)用流動相沖洗進(jìn)樣孔，以除去前一針留下的樣品。注射針必須清洗干凈。部分定量圈體積進(jìn)樣——當(dāng)樣品量少時，采用部分體積進(jìn)樣，進(jìn)樣量由微量注射器手動控制，要求：不得超過定量圈體積的1/2量目前四十八頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點三、分離系統(tǒng)-色譜柱柱材料和規(guī)格﹠不銹鋼管﹠柱管的內(nèi)徑：0.5～4.6mm﹠填料粒度：3～10μm﹠柱長度：10～25

cm常用色譜柱有：ODS柱、氰基柱、氨基柱等目前四十九頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點色譜柱使用注意點：pH范圍2-11.5。使用有機緩沖液，濃度以10-50mM為好。在中高pH下避免使用磷酸鹽，碳酸鹽緩沖液，最高操作溫度60℃，最佳溫度﹤40℃。分離堿性物質(zhì)，所用流動相pH值應(yīng)高于被測物pKa一個單位。目前五十頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點柱pH范圍最高溫度

SBC18

90℃C860℃C360℃苯基60℃腈基60℃XDB60℃Extend-C1860℃123456789101112ZORBAXRP-HPLC系列柱的使用條件目前五十一頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點保存色譜柱時用100%甲醇或乙腈，柱兩端必須用接頭密封。停用數(shù)天后最使用時，應(yīng)先用低流速甲醇沖洗1h左右，然后再換上流動相，否則直接用流動相，柱效會下降，峰形不好。新柱使用前應(yīng)用甲醇或乙腈沖洗（0.5ml/min）。目前五十二頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點1、要求：粒徑小、顆粒分布均勻傳質(zhì)快、滲透壓小機械強度高、能耐高壓化學(xué)穩(wěn)定性好HPLC的固定相目前五十三頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm。

目前五十四頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點

2.液-液分配及離子對分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體

氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見?，F(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料。（2）表面多孔型擔(dān)體

（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。目前五十五頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點（3）化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相：以硅膠為載體，借化學(xué)反應(yīng)方法將有機分子以共價鍵連接在硅醇基上a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C

穩(wěn)定，耐水，耐光，耐有機溶劑，應(yīng)用最廣。c.硅碳鍵型：≡Si—C目前五十六頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點化學(xué)鍵合固定相的特點：（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷。（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水，耐光，耐有機溶劑，穩(wěn)定。（4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性。（5）有利于梯度洗脫。目前五十七頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點化學(xué)鍵合固定相非極性鍵合相：十八烷基鍵合相（ODS，C18）中等極性鍵合相：醚基鍵合相極性鍵合相：氨基、氰基鍵合相目前五十八頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點反相鍵合相色譜法（RPBPC）固定相：采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37（ODS，C18）、硅膠-苯基等流動相：

采用極性較強的溶劑，如甲醇、乙睛-水、水和無機鹽的緩沖溶液等。目前五十九頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點分離機理——疏溶劑作用理論非極性的烷基鍵合相——硅膠表面的十八烷基“分子毛”——較強的疏水特性。目前六十頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點分子中非極性部分——疏水烷基——締合作用，分子保留分子極性部分——極性流動相——離開固定相，減小保留兩種作用力之差，決定分子在色譜中的保留行為流動相——極性溶劑分離物——極性官能團(tuán)有機物目前六十一頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點改變流動相配比可分離極性化合物用水和無機鹽的緩沖液為流動相可分離易離解的樣品有機酸、有機堿等。主要用于分離非極性至中等極性的各類有機化合物

用途

目前六十二頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點固定相：極性的有機基團(tuán)，CN、NH2。雙羥基等鍵合在硅膠表面流動相：非極性或極性小的溶劑（如正已烷）中加入適量極性溶劑（如氯仿、醇等）

分離機理：范德華力、誘導(dǎo)力或氫鍵力用途：多用于分離極性或中等極性化合物正相鍵合相色譜法（NPBPC）目前六十三頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點其它固定相離子交換固定相：離子交換樹脂、鍵合型離子交換樹脂空間排阻色譜固定相：凝膠手性固定相：手性官能團(tuán)鍵合或天然手性物質(zhì)固著在載體上如環(huán)糊精親合色譜固定相：生物專一性配基+載體目前六十四頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點5、檢測器主要作用：監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度變化，并由工作站記錄數(shù)據(jù)，定性、定量分析。

目前六十五頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點

紫外檢測器示差折光檢測器

熒光檢測器光電二極管陣列檢測器目前六十六頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點

a.紫外檢測器基于被分析組分對特定波長紫外光或可見光的選擇性吸收，應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。

靈敏度高；線性范圍寬；流通池可做得很小(1mm×10mm，容積8μL)；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。目前六十七頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點紫外-可見光檢測器光路示意圖目前六十八頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點可變波長紫外檢測器﹠

選用氘燈作為光源，在190—600nm范圍內(nèi)可連續(xù)調(diào)節(jié)，選擇不同的波長檢測目前六十九頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點b.光電二極管陣列檢測器（DAD）

紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖。目前七十頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點目前七十一頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點DAD檢測器的主要特點

①可以同時得到多個波長的色譜圖，可以計算不同波長處的相對吸收比②可以在色譜分離同時，對色譜峰的指定位置實時記錄吸收光譜圖，并得到最大吸收波長③在色譜運行期間，可以逐點進(jìn)行光譜掃描，得到時間—波長—吸收值為坐標(biāo)的三維圖形目前七十二頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點目前七十三頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點三維：光譜-色譜圖目前七十四頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點c.示差折光檢測器

（Differentialrefractiveindexdetector）

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器?？蛇B續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度成正比。

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）。靈敏度低，對溫度敏感，不能用于梯度洗脫。

目前七十五頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點光源調(diào)零光學(xué)零參比樣品平面鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換記錄儀放大器遮光板溶劑相和樣品+溶劑相對光的折射率不同，造成兩束光強度差變化，差示信號放大記錄代表樣品濃度通用型檢測器，靈敏度為10-7g/ml對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗目前七十六頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點d.熒光檢測器

（Fluorescencedetector）高靈敏度，高選擇性。對多環(huán)芳烴，維生素B，黃曲霉素，卟啉類化合物，農(nóng)藥，藥物，氨基酸，甾類化合物等有響應(yīng)。目前七十七頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點檢測器梯度

主要特點紫外-可見光可對流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很??；對溶質(zhì)的響應(yīng)變化大。熒光可選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、pH和溶劑的影響。化學(xué)發(fā)光困難靈敏度高；發(fā)光試劑受限；受流動相和脈動的影響。電導(dǎo)不可是離子性物質(zhì)的通用檢測器；受溫度和流速影響；不能用于有機溶劑體系。電化學(xué)困難選擇性高；受流動相pH值和雜質(zhì)的影響；穩(wěn)定性差。蒸發(fā)光散射可可檢測所有物質(zhì)。示差折光不可檢測所有物質(zhì)；不適合微量分析；對溫度變化敏感質(zhì)譜可主要用于定性和半定量。原子吸收光譜可選擇性高。ICP發(fā)射光譜可可進(jìn)行多元素同時檢測。火焰離子化可柱外峰展寬。目前七十八頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點數(shù)據(jù)處理和計算機控制系統(tǒng)色譜工作站在線顯示自動采集處理儲存自動控制目前七十九頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點HPLC的建立與應(yīng)用一、建立HPLC分析方法的一般步驟

1、根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種HPLC分離方式。材料來源、濃度范圍組分特性、結(jié)構(gòu)、分子量、溶解性等目前八十頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點

目前八十一頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點2、選擇合適的分析方法適用的色譜柱：柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長）和選用固定相（粒徑及孔徑）流動相檢測器樣品預(yù)處理目前八十二頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點3.分析條件的優(yōu)化流動相種類與配比梯度溫度流速檢測波長進(jìn)樣量目前八十三頁\總數(shù)九十二頁\編于二十點4、由獲得的色譜圖進(jìn)行定性分析和定量分析。目前八十四頁\總數(shù)九十