現(xiàn)代育種原理與方法

蛋白質(zhì)相互作用及其研究方法摘要：隨著人類基因組和其它物種基因組序列測定計(jì)劃的順利完成，生物學(xué)的研究從基因組時(shí)代步入后基因組時(shí)代。作為后基因組時(shí)代的重要研究領(lǐng)域之一的以蛋白質(zhì)間相互作用研究為中心發(fā)展起來的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域。研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)的相互作用即相互作用組，分析各種蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成及其作用方式對(duì)于我們理解生物體的復(fù)雜運(yùn)行機(jī)制至關(guān)重要。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)噬菌體展示技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)串聯(lián)親和純化隨著生命現(xiàn)象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉(zhuǎn)向研究基因功能，一門新的學(xué)科一一蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)組是一個(gè)在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化的整體，其功能往往是通過蛋白質(zhì)之間或與核酸之間相互作用而表現(xiàn)出來的，這種相互作用存在于機(jī)體每個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過程中，相互交叉形成網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成細(xì)胞中一系列重要生理活動(dòng)的基礎(chǔ)。因此，對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用的研究就成為蛋白質(zhì)組學(xué)中最主要研究內(nèi)容之一［1］。在過去的幾年時(shí)間里，研究人員提出了很多的方法來研究蛋白質(zhì)相互作用，有生物方法，也有計(jì)算生物學(xué)的方法。在這些方法之中，基于蛋白質(zhì)序列的預(yù)測方法得到了極大的關(guān)注。這類方法不需要先驗(yàn)知識(shí)，可以廣泛地用于蛋白質(zhì)相互作用的研究之中。蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用概述1.1蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)是由氨基酸通過膚鍵構(gòu)成的生物大分子化合物，生物體中的每一個(gè)細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。一些重要的蛋白質(zhì)功能包括：（1）酶的催化，例如淀粉在消化道內(nèi)由于淀粉酶的催化作用，迅速的被水解成單糖和雙糖；（2）運(yùn)輸和貯存，例如在細(xì)胞膜中，許多膜蛋白起運(yùn)輸葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的作用；（3）調(diào)節(jié)蛋白，例如激素通過與靶細(xì)胞相互作用發(fā)揮代謝上的作用；（4）機(jī)械支持，例如骨頭和皮膚的拉力強(qiáng)度是由于存在膠原蛋白。大多數(shù)結(jié)締組織主要由它構(gòu)成；（5）保護(hù)蛋白，例如免疫系統(tǒng)中抗體蛋白保護(hù)生物體不被其它生物入侵或保護(hù)生物體免受損害。由于高通量測序技術(shù)的發(fā)展，多個(gè)物種的基因組被測序。但是在這些基因組中大部分基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能是未知的。此外，由于蛋白質(zhì)功能的復(fù)雜性和多樣性，很多蛋白質(zhì)還有未被發(fā)現(xiàn)的功能。目前利用計(jì)算方法對(duì)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行預(yù)測和注釋已成為越來越有效的一種手段。細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)主要是通過蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用來實(shí)現(xiàn)其功能。蛋白質(zhì)相互作用存在于生物體每個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過程中，相互交叉形成網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成細(xì)胞中一系列重要生理活動(dòng)的基礎(chǔ)。我們可以利用蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性，對(duì)未知功能的蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋,也就是根據(jù)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中某個(gè)蛋白質(zhì)的連接情況從整體水平上預(yù)測蛋白質(zhì)的功能［2］。1.2蛋白質(zhì)的相互作用蛋白質(zhì)是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要執(zhí)行者和調(diào)控者。盡管有一些蛋白質(zhì)是以單體的形式發(fā)揮作用，但大部分蛋白質(zhì)卻是通過與其它蛋白質(zhì)或者配體分子結(jié)合來參與細(xì)胞中的生命活動(dòng)。蛋白質(zhì)分子的相互作用包括多種方式，有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)-DNA相互作用，蛋白質(zhì)-RNA相互作用等。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein一proteininteraction,PPI)指的是一個(gè)蛋白質(zhì)與另一個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，它們之間可以直接接觸(物理相互作用)，也可以不接觸，而僅是功能上關(guān)聯(lián)(遺傳相互作用)。蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用在生命活動(dòng)中起著核心作用，例如：DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、修飾和定位以及信息轉(zhuǎn)導(dǎo)等眾多生命過程中均涉及到蛋白質(zhì)相互作用。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的研究將能夠從分子水平上揭示蛋白質(zhì)的功能，幫助揭示生長發(fā)育、新陳代謝、分化和凋亡等細(xì)胞活動(dòng)的規(guī)律。同時(shí)，正確理解蛋白質(zhì)相互作用也為探討疾病機(jī)理、疾病治療、疾病預(yù)防以及藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和藥物設(shè)計(jì)等方面提供了重要的理論基礎(chǔ)。1.3蛋白質(zhì)相互作用機(jī)理蛋白質(zhì)相互作用在很大程度上是由疏水效應(yīng)驅(qū)動(dòng)的，氫鍵和靜電相互作用也起著至關(guān)重要的作用。此外，共價(jià)鍵也是很重要的。蛋白質(zhì)相互作用的物理化學(xué)原理是一般性的，在體外檢測到的很多蛋白質(zhì)相互作用是生物實(shí)驗(yàn)中的過表達(dá)或者晶體效應(yīng)造成的，從而加大了蛋白質(zhì)相互作用研究中的復(fù)雜性。為了能夠準(zhǔn)確預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用，我們也需要從化學(xué)角度來研究蛋白質(zhì)之間的相互聯(lián)系，包括形狀互補(bǔ)、氨基酸殘基組織、以及物理/化學(xué)結(jié)構(gòu)成分對(duì)相互作用穩(wěn)定的貢獻(xiàn)等。蛋白質(zhì)是通過其表面區(qū)域'與另外一個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的。因此對(duì)蛋白質(zhì)相互作用研究的焦點(diǎn)也就集中在蛋白質(zhì)的結(jié)合表面這一部分。一般我們是通過計(jì)算殘基或原子的溶劑可及表面積(solventaccessiblesurfacearea,SASA)來判斷蛋白質(zhì)中哪些殘基或原子是處于蛋白質(zhì)結(jié)合面的。如果一個(gè)蛋白質(zhì)分子與另一個(gè)蛋白質(zhì)分子之間有相互作用，那么位于其中一個(gè)蛋白質(zhì)分子表面的原子將會(huì)與對(duì)應(yīng)的另一個(gè)蛋白質(zhì)分子表面的原子發(fā)生相互作用。為了理解蛋白質(zhì)分子間的相互作用，人們對(duì)蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合面的性質(zhì)作了深入研究。這些性質(zhì)包括相互作用的強(qiáng)度!結(jié)合面的形狀及組成!殘基的疏水性、進(jìn)化保守性、溶劑可及表面積和二級(jí)結(jié)構(gòu)等。雖然這些屬性對(duì)于我們理解蛋白質(zhì)相互作用來說都是必要的，但它們對(duì)蛋白質(zhì)之間結(jié)合的描述還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。這也是目前要正確預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用所面臨的一個(gè)很大困難［3］ 。1.4蛋白質(zhì)結(jié)合面中的熱點(diǎn)殘基熱點(diǎn)殘基通常被定義為丙氨酸突變后引起結(jié)合自由能的變化值大于等于2.0kcal/mol的那些結(jié)合面上的殘基。熱點(diǎn)殘基有聚集在一起的傾向，它們之間的相互接觸而形成了一個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)，我們稱之為熱區(qū)(hotregions)。由于結(jié)合面大小的不同，一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合面上可能有多個(gè)熱區(qū)。在一個(gè)熱區(qū)內(nèi)的熱點(diǎn)殘基對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定所發(fā)揮的作用是協(xié)同性的；而各個(gè)熱區(qū)之間是相互獨(dú)立的，它們對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定性作用則是具有累加性的［4］ 。這就說明在緊密包裝的熱區(qū)之間，是有一定的空隙的，從而使得蛋白質(zhì)之間的結(jié)合是有一定的柔性的。這與蛋白質(zhì)的折疊過程是有一定的相似性的。蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法最初研究蛋白質(zhì)相互作用的方法都是基于生物實(shí)驗(yàn)的方法，諸如電泳，層析，質(zhì)譜分析，核磁共振等技術(shù)。這些生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)研究中自始至終一直發(fā)揮著極其重要的作用。隨著新技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)研究進(jìn)入了新的階段，高通量技術(shù)的發(fā)展使得在更短的時(shí)間內(nèi)鑒定出更多的蛋白質(zhì)及其相互作用關(guān)系成為可能。迄今已發(fā)展了包括經(jīng)典的噬菌體展示技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)以及新近發(fā)展并廣泛應(yīng)用的串聯(lián)親和純化和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、表面等離子共振技術(shù)等多種有效的研究蛋白質(zhì)間相互作用的高通量分析方法，為蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2.1噬菌體展示技術(shù)(PDT)1985年，美國Missouri大學(xué)Smith博士等人［5］將RI核酸內(nèi)切酶基因片段連接到絲狀噬菌體fd編碼次要外殼蛋白的基因III中，成功地得到了在外殼蛋白中融合表達(dá)了酶分子的噬菌體顆粒。后經(jīng)驗(yàn)證，該噬菌體能被EcoRI核酸內(nèi)切酶抗體有效中和，說明展示在噬菌體外殼表面的酶分子具有與天然酶分子相同或極其相近的構(gòu)象和活性，這一試驗(yàn)的成功標(biāo)志著噬菌體展示技術(shù)(Phagedisplaytechniques,PDT)的誕生。噬菌體展示技術(shù)是在噬菌體展示肽庫建立之后才開始廣泛應(yīng)用到蛋白質(zhì)相互作用研究的。1990年Scott等人［6］利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了隨機(jī)多肽文庫，該文庫由特定長度的隨機(jī)短肽組成，理論上包含了某一固定長度短肽所有氨基酸的排列組合方式。由于蛋白質(zhì)間的識(shí)別與結(jié)合主要取決于局部肽段中少數(shù)幾個(gè)氨基酸，所以用受體蛋白對(duì)隨機(jī)肽庫進(jìn)行親和篩選，就能得到之結(jié)合的短肽序列，根據(jù)此短肽的序列，就可以得到與目的蛋白相互作用所依賴的氨基酸殘基［7］，從而可以進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)之間的分子識(shí)別，酶與底物的結(jié)合等等，突破了傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)相互作用時(shí)需對(duì)其結(jié)構(gòu)詳盡了解的限制。噬菌體展示技術(shù)最大的特點(diǎn)在于被展示在噬菌體表面的多肽或蛋白質(zhì)可保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，建立起了基因型和表現(xiàn)型之間的一致性。2.2酵母雙雜交系統(tǒng)(Y2H)酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)是1989年由Fields等［8］提出并初步建立的，主要用于研究真核生物的蛋白質(zhì)，到現(xiàn)在，雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)成為檢測和鑒定蛋白質(zhì)相互作用的標(biāo)準(zhǔn)方法，并且在旨在建立一系列蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的蛋白質(zhì)組研究中扮演著重要角色［9］。Y2H的建立是基于人們對(duì)酵母半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的詳細(xì)了解。GAL4包括兩個(gè)可以獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域:N末端的DNA結(jié)合域(DNA-bindingdomain,DNA-BD)和C末端的轉(zhuǎn)錄激活域(Transcriptionactivatingdomain,DNA-AD)。DNA-BD可以與DNA分子的上游激活序列結(jié)合，DNA-AD則可以激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)兩者在空間上充分接近時(shí)才會(huì)共同作用激活轉(zhuǎn)錄活性。雙雜交技術(shù)正是利用了GAL4的這一特點(diǎn)，將欲研究的兩個(gè)目標(biāo)蛋白的編碼序列分別與GAL4的結(jié)合域和激活域的編碼序列融合，構(gòu)建成兩個(gè)雜交系統(tǒng)；再將這兩個(gè)雜交系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)化至含有報(bào)告基因的酵母細(xì)胞株；若兩個(gè)目標(biāo)蛋白發(fā)生相互作用，則會(huì)使DNA-BD和DNA-AD在空間上靠近進(jìn)而激活報(bào)告基因的表達(dá)。2.3串聯(lián)親和純化(TAP)串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypuri-fication，TAP)是1999年Rigaut［10］等人共同提出了一套分離復(fù)合蛋白的新方法，兼具標(biāo)準(zhǔn)親和純化和免疫共沉淀兩種生化方法的優(yōu)點(diǎn)，為蛋白質(zhì)復(fù)合體的分離鑒定提供了一條新路徑。串聯(lián)親和純化技術(shù)首先需通過基因工程給被分離純化蛋白的一端加一個(gè)TAP標(biāo)簽，該標(biāo)簽由IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ProtA)及一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(CBP)組成，結(jié)構(gòu)域與多肽之間由一個(gè)TEV蛋白酶切位點(diǎn)隔開。通過基因重組將細(xì)胞內(nèi)源性的目標(biāo)蛋白基因置換為帶有TAP標(biāo)簽的基因，溫和裂解細(xì)胞，獲取細(xì)胞抽提物，將抽提物加入IgG親和柱，TAP標(biāo)簽的ProtA端會(huì)與IgG形成強(qiáng)結(jié)合，在用洗脫液洗脫掉大部分非特異性結(jié)合物和雜蛋白后，再用含有TEV蛋白酶的洗脫夜將蛋白質(zhì)復(fù)合體切割下來。在鈣離子參與下，被切割下來帶有CBP的蛋白質(zhì)復(fù)合體與鈣調(diào)蛋白緊密結(jié)合，充分洗脫就可以進(jìn)一步去除非特異作用的蛋白質(zhì)雜質(zhì),最后純化出高純度的目的蛋白復(fù)合體。3蛋白質(zhì)相互作用研究方法展望機(jī)體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間相互交叉作用形成網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成各項(xiàng)生理活動(dòng)的基礎(chǔ)。因此了解、闡明蛋白質(zhì)之間相互作用的機(jī)制意義重大。各種新的研究技術(shù)不斷涌現(xiàn)，尤其隨著生物信息學(xué)的出現(xiàn)，多種方法技術(shù)并存，相互間交叉互補(bǔ)，已愈來愈成為研究蛋白質(zhì)相互作用研究方法的主要特點(diǎn)，對(duì)于準(zhǔn)確理解蛋白質(zhì)功能、揭開各種細(xì)胞活動(dòng)的奧秘具有重大的意義，勢必會(huì)引導(dǎo)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展進(jìn)入一個(gè)全盛時(shí)期。參考文獻(xiàn).王海波，安學(xué)麗，張艷貞，等.蛋白質(zhì)相互作用研究方法及其應(yīng)用[J],生物技術(shù)通報(bào),2006：167-170..StrongM,MalliekP,PellegriniM,etal.2003.InferenceofProteinfunctionandProteinlinkagesinMycobacteriumtuberculosisbasedonprokaryoticgenomeorganization:acombinedcomputationalapproach[J].GenomeBiol,4(9):R59..夏俊峰.2010.蛋有質(zhì)相互作用及其結(jié)合面熱點(diǎn)殘基的預(yù)側(cè)方法研究[D].中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)博士學(xué)位論文..KeskinO,MaB,NussinovR.2005.HotregionsinProtein-Proteininteractions:theorganizationandcontributionofstructurallyconservedhotspotresidues[J]:Journalofmolecularbiology,345(5):1281一1294..SmithGP.Science,1985,228(4705):1315?1317..ScottJ