毛細管電泳課件

毛細管電泳

CapillaryElectrophoresis第一節(jié)毛細管電泳概述第二節(jié)毛細管電泳基礎理論第三節(jié)毛細管電泳儀第四節(jié)毛細管電泳類型第五節(jié)毛細管電泳的應用和進展第一節(jié)毛細管電泳概述毛細管電泳（CE），又稱高效毛細管電泳，是近年來發(fā)展最快的高效分離分析技術之一。該技術是現(xiàn)代微柱分離技術和經典電泳技術結合的產物，是氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)等常用分離技術的重要補充，在諸多研究領域得到了人們廣泛的接受和認可。一、毛細管電泳發(fā)展歷程1808年，俄國物理學家Pence發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1937年，瑞典Tiselius將蛋白質混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定,第一次從人血清提取的蛋白質混合液中分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白，但分離效率低；1981年，Jorgenson在75μm毛細管內施加300V/cm的高強度電場，獲得了理論塔板數(shù)超過400,000plates/m的高分離效率，轟動了整個分離界，成為CE劃時代里程碑1989年，毛細管電泳儀問世。

1989年，第一屆CE國際會議的召開，標志著一門新的分析技術的產生。二、毛細管電泳的特點(1)高效：每米理論塔扳數(shù)低則十幾萬，高則幾百萬甚至上千萬；(2)快速：可在十幾分鐘甚至幾十秒內完成分離；(3)低樣品消耗：只需納升甚至皮升級樣品量；(4)低成本分析：只需低廉的分離毛細管和少量的運行緩沖液；

CE是現(xiàn)代微柱分離和經典電泳技術有機結合的產物，具有較HPLC和平板凝膠電泳更多的優(yōu)點：(5)高度自動化：CE是目前自動化程度最高的分離分析方法之一；(6)潔凈：通常用水溶性緩沖液，對人體和環(huán)境無害；(7)多分離模式：可根據(jù)需要在同一儀器上選用不同的樣品分離模式；(8)應用范圍廣：具有“萬能”分析的功能和潛力，既可以分析無機離子、氨基酸、藥物等小分子，又可以分析蛋白質等生物大分子,甚至整個細胞。第二節(jié)毛細管電泳基礎理論+—一、電泳流電泳：在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象。電泳時，不同離子在電場中具有不同的定向遷移速度，遷移速度與哪些因素有關？淌度(μ）：單位電場下的電泳速度。絕對淌度：在無限稀釋溶液中測得的淌度。有效電泳淌度：在實際溶液中測得的淌度。+—電場強度：與所施加的電壓成正比，與兩電極間的距離（L）成反比

E=V/L電場力：在溶液中，電場對帶電離子作用力（F）的大小等于帶電離子所帶的凈電荷（q）與電場強度的乘積：F=q·E在電泳遷移過程中，介質粘滯力（F’）必然會阻礙離子的遷移。粘滯力的大小與離子大小、形狀、緩沖液粘度、甚至電泳介質孔徑均有關系，與帶電離子的移動速度更是直接相關。對于球形分子F’的大小服從Stokes定律：F’=6πηrνefη：緩沖液粘度；r：球形分子的半徑；νef：離子在電場中的遷移速度。當帶電離子以速度v在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場驅動力和移動摩擦阻力的作用，此時F=F’故：q·E=6πηrνef則離子在電場中的遷移速度：即帶電離子的電泳遷移速率（或稱電泳淌度）:由此可知，球形帶電離子的遷移率，主要取決于自身狀態(tài)，即與其所帶電量成正比，與其半徑及介質粘度成反比。電泳過程中正是利用帶電離子電泳遷移速度或遷移速率的差異來實現(xiàn)分離的。

二、電滲流在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，形成電滲流。石英毛細管柱，內壁大約有8.31mol/m2的硅醇基（Si-OH），其等電點約為1.5，內充液pH>3時，表面電離成SiO-，管內壁帶負電荷，形成雙電層。1.CE中電滲流的大小與方向

電滲流的大小可用電滲速度和電滲淌度表示。（1）電滲流的大小電滲流的大小與電場強度、Zata電勢及緩沖液介電常數(shù)有關，某一電泳體系內電滲流的具體數(shù)值可以用Helmholtz-Smoluchowski公式計算：式中，為電滲速度；為電滲淌度（EOFmobility）；為雙電層的Zeta電位；為緩沖液介電常數(shù)；η為電解液粘度；V為所施加的電壓；為毛細管總長度。在具體實驗中，可根據(jù)需要選用不同的中性組分作為標記物（N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、甲酰胺、苯酚、丙酮等），測定不同緩沖條件下中性標記物的遷移時間，按下述公式計算出電滲率：其中，t：中性標記物的遷移時間，ldet為毛細管電泳有效長度，ltot為毛細管電泳有效長度。

（2）CE中電滲流的方向石英毛細管帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：毛細管改性：表面鍵合陽離子基團；加電滲流反轉劑:

內充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷，電滲流流向陽極。2.CE中電滲流的流形液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速最慢，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。在毛細管電泳中，電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（區(qū)帶展寬很?。手л^高。3.CE中電割滲流剃的作置用電滲襖流的受速度遵一般庸約等長于離睡子電喬泳速嚇度的5～7倍；各種的電性房誠粒子坦在毛門細管業(yè)柱中栗的遷帆移速息度為聽：陽離雹子遷駐移速串度=電滲泊流+電泳江流，敞陽離飛子運柏動速臂度快饅于電庫滲流論；陰離北子遷冒移速混度=電滲咱流–電泳短流，悄陰離名子運恥動速舌度慢混于電聚滲流柿；中性露粒子找遷移撿速度=電滲纏流，關中性輝粒子寇運動職速度割與電轉滲流秘一致個。CE中電補滲流凝的作資用：可一糞次完自成陽貢離子煩、陰普離子義、中兔性粒皇子的瀉分離夜；改變孩電滲跪流的沉大小鄭和方掠向可療改變鐵分離啄效率督和選鎮(zhèn)擇性電滲飼流的拿微小習變化停影響老結果攤的重跡現(xiàn)性坐；在CE中，茅控制味電滲并流非昂常重憑要。+—4.夕CE中影銀響電藍滲流至的因惜素（1）電轟場強鐵度的霞影響電滲沈流速威度和駐電場幅強度騙成正女比，噸當毛蛋細管滲長度炭一定賣時，勝電滲蘆流速武度正診比于漢工作障電壓色。（2）毛匯細管傲材料警的影咱響不同告材料復毛細城管的潑表面律電荷腎特性偏不同迫，產揚生的頓電滲歡流大剃小不熔同。（3）電烏解質屋溶液濁性質強的影泳響①溶液pH的影忌響對于筋石英擔毛細偉管，吧溶液pH增高設時，敢表面挎電離湊多，筆電荷宴密度星增加粒，管水壁ze交ta電勢冤增大果，電拳滲流幻玉增大棟。pH在4-所7之間繩，電批滲流虛增大輔顯著；pH君>8時電火滲流錘增大占速度栗漸緩勻。當pH菊<3，毛刊細管晨內壁黑離解董的硅恥醇基濱被氫錯離子濾中和宴，表既面接現(xiàn)近電港中性濃，電英滲流港接近陣零。驚分析蝦時，賽可采男用緩鬧沖溶適液來猶穩(wěn)定貨并調騾控pH。②陰離噸子的烤影響在其或它條四件相恒同，因緩沖毀液濃蜘度相錦同而迎陰離涌子不安同時擊，毛到細管痛中的奔電流夠有較戲大差醒別，甲產生吸的電銳滲流襯不同醋。（4）溫幫度的澆影響毛細奪管內預溫度碧升高更，使共溶液頑的黏古度下小降，慶電滲驢流增吹大。溫度器變化套來自床于“吼焦耳吩熱”息；焦耳饑熱：毛址細管楚溶液炸中有恭電流朵通過據(jù)時，飯產生雕的熱練量；CE中的忽焦耳許熱與奔背景潮電解萄質的診摩爾禾電導澆、濃腹度及晨電場牙強度市成正斃比。溫度閑每變期化1度，海將引坐起背飯景電皺解質鑒溶液澆黏度冤變化2%～3%；（5）添總加劑質的影須響加入糊濃度鳴較大施的中豬性鹽扔，如K2SO4，溶搭液離鍛子強頌度增渴大，那使溶卡液的蠶黏度晝增大呢，電銹滲流吊減小蛋。加入級表面扶活性保劑，味可改蜻變電橡滲流晶的大眠小和鬧方向夏；加入誦不同運陽離借子表禮面活愚性劑聞來控斧制電頭滲流塞。加入編陰離秧子表稱面活明性劑馬，如符十二響烷基魂硫酸采鈉（SD退S），采可以密使壁知表面出負電洪荷增怎加，ze競ta電勢勵增大駁，電冬滲流巧增大衛(wèi)；加入績有機洗溶劑注如甲討醇、戲乙腈趟，使冷電滲中流增駁大。三、CE中的級參數(shù)數(shù)與關刑系式1.遷移每時間向（保驕留時決間）CE兼具坊有電狗化學阻的特鼓性和捏色譜什分析槍的特熄性。敏有關鬼色譜焰理論考也適羽用。Vap是表尚觀遷戶移速使度；μap是表預觀淌你度；lde翠t是毛皺細管肯有效井長度肢；lto悔t是毛灶細管奮總長翁度2.分離腔效率準（塔怕板數(shù)拒）在CE中，掘僅存挺在縱螞向擴場散，σ2=2Dt擴散繩系數(shù)帖小的洞溶質盤比擴因散系份數(shù)大鞋的分土離效足率高埋，這寶是分冬離生倒物大銅分子吧的依旨據(jù)。3.分離組度四、終影響保分離航效率壓的因拆素—區(qū)帶壟展寬1.縱向柜擴散意的影巧響在CE中，闊縱向竄擴散陷引起協(xié)的峰徐展寬您：σ2=2Dt由擴閘散系塌數(shù)和卸遷移獎時間席決定喪。大向分子薄的擴毫散系戀數(shù)小吧，可獲得趣更高利的分辮離效央率。2.進樣廚的影寄響當進隸樣塞事長度鑼太大葛時，歡引起勉的峰父展寬雷大于珍縱向墻擴散贏。分冤離效虹率明辰顯下獅降；俘理想林情況皆下，麗進樣給塞長流度：Win鞭j=刪(2采4D適t)1/膜2實際膛操作朗時進疊樣塞摘長度映小于梨或等躲于毛襪細管潔總長車度的1%～2%。3.焦耳馳熱與端溫度辭梯度脖的影駱響電泳炎過程化產生罷的焦叼耳熱劍可由酸下式顧計算掠：m：電解盤質溶恰液的量摩爾宵電導故；I：工候作電投流：cm：電仇解質質濃度琴；散熱堵過程紅中，報在毛杏細管脖內形漲成溫祖度梯論度（偉中心器溫度巧高）克，破辰壞了秒塞流攀，導算致區(qū)規(guī)帶展攜寬。改善焰方法流：（1）減焦小毛糊細管宿內徑驗；（2）控悉制散氣熱；4.溶質奇與管鐘壁間蜘的相德互作努用蛋白浴質、彈多肽呈帶電角荷數(shù)陶多，仆吸附臘問題良特別尺嚴重莖，是頸目前湊分離奇分析株該類負物質仁的一蘋大難題。細內僅徑毛頸細管塑柱，暫一方塘面有罵利于兼散熱泳，另瞞一方得面比鑒表面蒸積大皇，又姓增加賤了溶統(tǒng)質吸奧附的迷機會捕。減小擊吸附你的方瞞法和筐途徑：加入寇兩性谷離子海代替鵲強電鄭解質室，兩福性離篇子一局端帶撞正電及，另氣一端優(yōu)帶負棉電，寶帶正征電一私端與卷管壁草負電鳴中心慌作用柜，濃罩度約硬為溶被質的10視0-脹10樓00倍時敏，抑法制對磨蛋白陣質吸蹈附，勻又不覺增加午溶液蕩電導磨，對緣瑞電滲臺流影粒響不幅大。第三療節(jié)術毛細摸管電斤泳儀一、勸儀器傍主要歇部件1.高壓鼓電源（1）0～30kV穩(wěn)定處、連梨續(xù)可昌調的飼直流洽電源烈；（2）具知有恒熊壓、鄭恒流躲、恒清功率睜輸出稈；（3）電扔場強剪度程沈序控科制系革統(tǒng)；（4）電餐壓穩(wěn)茄定性款：0.兆1隊%；（5）電破源極盼性易米轉換；2.毛細喜管毛細縱管是CE分離伍的心慕臟。液理想借的毛潮細管碗必須就是電串絕緣抬、紫謝外/可見錯光透吩明且桃富有弟彈性竄的，引目前點可以曬使用往的有古玻璃既、熔湖融石另英或殘聚四旋氟乙犯烯塑蠻料等形。毛錘細管制內徑蘆一般差為20～10朵0μm。3.緩沖夸液池化學癢惰性摸，機苗械穩(wěn)約定性富好；4.檢測沃器要求緣瑞：具蹤蝶有極膠高靈碗敏度用，可渾柱端衫檢測堡；檢測策器、飛數(shù)據(jù)店采集積與計泊算機沫數(shù)據(jù)泰處理紫一體喇化；類型專檢測巡壽限/m散ol特點紫外-可見10-1果3～10-1齊5加二烤極管爹陣列致，光徒譜信壯息熒光10-1深5～10-1掘7靈敏愉度高虜，樣拋品需敵衍生激光牙誘導瓶熒光10-1膨8～10-2等0靈敏緣瑞度極飄高，灰樣品剖需衍稅生電導10-1桌8～10-1妨9離子勢靈敏券，需練專用典的裝陸置；二、族毛細椒管電筋泳的給進樣游方式進樣線量：嚷毛細買管長頌度的1-西2%；納靜升級恩、非敞常小蠶；1.流體痛力學俯進樣托方式（1）進感樣端綁加壓（2）出芹口端涂抽真縱空（3）虹律吸進腔樣毛細暗管一痛端插燈入樣日品瓶積，加色電壓腔；2.電動盒進樣荒方式進樣旁不均：電改歧視頭現(xiàn)象其，淌匪度大狼的離販子比寶淌度切小的旦進樣撫量大夠；離子吩丟失：淌捏度大忍且與與電滲勿流方券向相賓反的市離子告可能個進不降去；特別深適合推黏度摟大的含試樣地。3.擴散雷進樣試樣搏通過矩擴散研作用爆進入通分離宰柱端班口處廁。第四能節(jié)譽毛細甘管電栽泳類郵型常用貿的六李種電閉泳分形離模絲式式；根據(jù)鍋試樣任性質俯不同紐奉，采填用不場同的捐分離隙類型秧；每種蛛機理嚼的選屑擇性躁不同型；一、俱毛細題管區(qū)縣帶電緞泳（Ca女pi判l(wèi)l名ar宇y勢zo樸ne優(yōu)e拼le會ct筆ro河ph缺or輔es妥is馳,丸C柱ZE）帶電抄粒子匙的遷尿移速叛度=電泳卻和電太滲流堤速度拴的矢枯量和尺。正離寶子：兩事種效偏應的漢運動牢方向致一致喜，在員負極縣最先使流出默；中性駛粒子：無因電泳察現(xiàn)象旺，受惑電滲慣流影咬響，喝在陽步離子農后流谷出；陰離屬子：兩殊種效頌應的柄運動掙方向鍵相反終；ν電滲丹流>ν電泳時,陰離聯(lián)子在占負極廚最后桃流出,在這涂種情扭況下,不但榆可以云按類墓分離,同種窄類離蠢子由擠于差速擠遷移被相初互分經離。CZ結E是最狐基本繡、應櫻用廣援的分凝離模傘式；二、付毛細框管凝擠膠電示泳Ca受pi王ll乓ar頂y鹿ge野l(fā)虛el屠ec牌tr哀op羅ho渠re修si勿s，CG賢E將聚器丙烯我酰胺滔等在粒毛細寧管柱竊內交話聯(lián)生閉成凝燒膠。其具襪有多戲孔性蘆，類弱似分膠子篩知的作允用，水試樣動分子已按大公小分寸離。所能夠遮有效械減小用組分塞擴散狐，所討得峰闊型尖獵銳，逆分離設效率栽高。蛋白害質、DN聚A等的慶電荷/質量室比與些分子黃大小毛無關勾，CZ羽E模式抵很難繼分離斃，采俊用CG榜E能獲嘉得良怠好分繁離，DN號A排序冊的重躁要手仁段。特點：抗對穗流性漁好，持散熱專性好率，分躲離度走極高獵。無膠要篩分皂技術：采用膜低粘維度的匆線性情聚合清物溶梢液代牧替高逢粘度合交聯(lián)政聚丙左烯酰問胺，番柱便雷宜、延易制淚備。1.緩沖錫溶液評中加舒入離召子型合表面昆活性毀劑，御其濃捎度達阻到臨零界濃撞度，紀形成化一疏沒水內粉核、襲外部突帶負羊電的悲膠束黎。三、姥膠梯束電悠動毛鳳細管欺色譜樹（ME抖CC，ME畢KC）Mi闖ce區(qū)ll踏ar泳e慶le柔ct漢ro悄ki厭ne足ti覽c視ca坦pi看ll牌ar味y片ch諸ro悄ma邪to移gr香ap敞hy量,恨ME廟KC在電介場力踏的作蠅用下尼，膠簡束在形柱中蘿移動羅。2.電泳蔽流和睡電滲出流的長方向砍相反賽，且ν電滲榜流>ν電泳，負獎電膠漠束以齊較慢皮的速聽度向染負極風移動漫；5.色譜談與電診泳分扣離模椅式的忍結合姿。3.中性慈分子枝在膠打束相符和溶懇液（買水相撿）間后分配退，疏塑水性銜強的辨組分神與膠慢束結邁合的斑較牢諷，流儉出時吹間長絞；4.可用錫來分輕離中薯性物躁質，寺擴展舊了高壩效毛屑細管膠電泳縮慧的應廁用范仇圍；根據(jù)素等電朗點差傳別分懸離生今物大樸分子絨的高夜分辨尋率電電泳技北術；2.毛細偽管內謎充有預兩性牌電解阻質（呀合成待的具嘆有不柜同等覺電點逐范圍飲的脂吊肪族啞多胺偷基多凍羧酸景混合鮮物）凳，當幫施加增直流主電壓彎（6～8.0籮k蛋V）時拍，管所內將槐建立皂一個薦由陽窮極到框陰極猜逐步并升高政的pH梯度餡；3.氨基行酸、敢蛋白袍質、慣多肽截等的粒所帶獵電荷英與溶檔液pH有關煌，在院酸性頌溶液壇中帶甩正電銹荷，記反之扁帶負德電荷大。在址其等燥電點餅時，貍呈電盡中性植，淌退度為尊零；四、袋毛細軟管等豎電聚殖焦Ca銜pi瞧ll商ar也y胃is聽oe如le向ct機ri徒c命fo沖cu虹si把ng映,象CI勝EF4.聚焦德：具耳有不提同等凍電點您的生彈物試洲樣在火電場歲力的芝作用挽下遷粉移，葛分別巡壽到達繁滿足情其等桂電點pH的位吼置時致，呈者電中巧性，脊停止系移動遮，形特成窄師溶質碗帶而本相互矩分離頌；5.陽極肥端裝臉稀磷您酸溶謀液，童陰極惱端裝刷稀Na聾OH溶液賴；6.加壓篇將毛界細管赤內分譽離后埋的溶哨液推卡出經腿過檢陽測器年檢測功；7.電滲背流在CI書EF中不拳利，柱應消僻除或取減小敢。1.將兩支種淌句度差塔別很摘大的淹緩沖蹄液分詳別作性為前凝導離索子(充滿腫毛細嗚管)和尾豆隨離善子，剃試樣服離子蝴的淌壩度全果部位勤于兩辭者之租間，會并以掀同一球速度犁移動秘。2.負離肥子分倘析時澡，前趨導電融解質全的淌竟度大較于試男樣中堡所有給負離饞子的始。所遇有試溫樣都蓬按前晴導離贊子的優(yōu)速度對等速芹向陽潔極前并進，支逐漸塑形成嚇各自胃獨立隸的區(qū)運帶而閥分離誕。陰陪極進僅樣，炭陽極態(tài)檢測膏。五、譽毛細陶管等譜速電雖泳Ca悶pi形ll巡壽ar冬y刑is屢ot音ac滿ho計ph漸or會es每is，CI孝TP3.不同緞離子巴的淌軋度不稼同，隸所形娘成區(qū)般帶的址電場趟強度朱不同(ν=盡μE)，淌尺度大戀的離肺子區(qū)貼帶電反場強難度小轎。沿出晌口到鈔進口糠，將聚不同呆區(qū)帶胞依次伏排序1、2、3、4證啊睛電場西強度演依次職增大羞。假濃設“2”號中拐離子析擴散副到“3”號，上該區(qū)汗電場碎強度振大，莊離子立被加央速，愚返回懂到“2”區(qū)；車當“2”號中崗離子禽跑到怕“1”號區(qū)偷，離查子被計減速鐵使之晴歸隊堂；4.特點稍：界拒面明遷顯，雜富集秒、濃梢縮作惕用。在毛禁細管鎖壁上件鍵合庫或涂喝漬高繪效液羞相色腰譜的皺固定賽液，勺以含呢有機襖物的驕緩沖肥液為靠流動風相，啊以電凡滲流剪為驅顫動力垮，試換樣組滋分在蛙兩相更間的溉分配畜為分俗離機窗理的撿電動暈色譜禮過程命；六、她毛細掃管電棋色譜Ca返pi怒ll川ar努y綠el紙ec邀tr池oo炸sm備os讓ti莖c繼ch澡ro英ma比to奸gr夢ap銹hy，CE而C一、蹄離子扶分析陽離難子分詠析遷移柜方向奇和電疾滲流錦方向烏一致吧；4.府5網(wǎng)mi毅n內分炸離了24種金燈屬離圣子；陽極懶進樣殊，陰滅極檢文測；具有擁很高韻的靈碰敏度什。第五福節(jié)靜毛細綁管電古泳的匠應用往與進綁展陰離傅子分笛析陰離駁子電產泳方脂向和功電滲蒼流方暑向相無反、奶速度說接近沒，分足析時凝間長帥、效襯率低肢；質量需小、替電荷衡密度巷大的我離子本如：SO42-、Cl-、F-等，敲電泳懼速率歪大于移電滲撫流，字陽極不端流傭出，榴在陰準極端遇無法天檢測資；加入蹦電滲乒流改匪性劑心，十剩六烷沖基三禽甲基偉溴化乎胺等抗，使彈電泳港方向休和電慢滲流勝方向紗一致然，可岸在3.退1母mi肚n內分字離36種陰次離子元；陰退極進納樣，責陽極遍檢測羊；離子謠價態(tài)胃及存壯在形咽態(tài)分蔑析；二、傘藥物局分析檢測畢體液嶺或細希胞中只某些何代謝聾產物括的分驗析；尿液隊中的飾氨基揉酸含書量作呈為臨盈床診立斷糖盞尿病郵