淺論TFF3在大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍胃黏膜不同部位的表達(dá)

淺論TFF3在大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍胃黏膜不同部位的表達(dá)【摘要】目的：探討大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍期間，三葉肽因子3(trefoilfactor3，TFF3)免疫反應(yīng)細(xì)胞在胃黏膜不同部位中表達(dá)的變化。方法：通過胃前壁黏膜下注射冰乙酸制備大鼠胃潰瘍模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測36只大鼠不同部位胃黏膜組織中TFF3的表達(dá)。結(jié)果：(1)胃潰瘍損傷后大鼠胃黏膜TFF3的陽性表達(dá)率為%(23/36)。(2)潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度要顯著高于遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位()。其中，潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度從大鼠胃潰瘍損傷后的第2天開始到損傷后的第6天呈遞增趨勢，且顯著高于對應(yīng)時期的遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位();而損傷后的第1天以及第10天以后，潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度與遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位差異沒有顯著性意義()。結(jié)論：大鼠胃潰瘍期間TFF3表達(dá)增高，潰瘍周邊部位TFF3的表達(dá)更強(qiáng)，TFF3對潰瘍損傷起著保護(hù)及修復(fù)作用。

【關(guān)鍵詞】胃潰瘍;三葉肽因子3;免疫組織化學(xué);大鼠

【ABSTRACT】Objective:ToexplorethechangesofTFF3immunoreactivecellsindifferentpositionofgastricmucosaduringexperimentalgastric:AceticacidinducedulcerswerecausedbyinjectionaceticacidtosubserosalofpariesanteriorexpressionsofTFF3in36ratsweredetectedbyimmunohistochemicalSPmethodwithanti:(1)Ingastriculcer,TFF3expressionratewas%ofcases.(2)Thenumericaldensitiesonarea(NA)aroundtheulcerationwerestrongerthanthatfarawayfromit(),especiallyamongtheseconddaytothesixthdayaftertheexperimentalgastriculcerinrats().Butinthefirstdayandaftertenthdayofgastriculcer,thetwogroupshadnostatisticalsignificance().Conclusion:TheexpressionofTFF3duringgastriculcerisexpressionisstrongeraroundtheulcerationthanthatfarawayfromcanprotectandrespairthemucosaofgastriculcer.

【KEYWORDS】Stomachulcer,Trefoilfactor3,Immunohistochemistry,Rats

三葉因子家族(trefoilfactorfamily,TFF)是一群主要由胃腸道粘液細(xì)胞分泌的小分子多肽。目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的三葉肽(trefoilpeptide)有3種，即乳癌相關(guān)肽(pS2或TFF1)、解痙多肽(SP或TFF2)和腸三葉因子(ITF或TFF3)[1]。其中TFF3是在1991年由Suemori等從大鼠空腸中發(fā)現(xiàn)的，分子僅由59個氨基酸組成，含有1個P結(jié)構(gòu)域。正常情況下，TFF的主要表達(dá)位點(diǎn)是在胃腸道，且有區(qū)域性和細(xì)胞選擇性。TFF1在正常組織中主要由胃竇和胃體的隱窩及表層上皮的黏膜細(xì)胞產(chǎn)生;TFF2主要分布于遠(yuǎn)端胃和下段十二指腸腺;TFF3主要分布于腸黏膜。當(dāng)胃腸黏膜受損時，三者表達(dá)的組織專一性消失。國外學(xué)者報道實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍期間胃黏膜出現(xiàn)TFF3高表達(dá)。但胃潰瘍形成及愈合過程胃黏膜不同部位TFF3的報道少見。我們通過大鼠乙酸潰瘍模型，檢測大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍形成及自愈過程不同部位TFF3的改變。

1材料與方法

大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型的制作

雄性8周齡SD大鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)共36只，體質(zhì)量180～230g。用3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉。胸腹部剃毛，消毒，在無菌條件下(手術(shù)切口長約2cm)暴露胃。在胃前壁近胃竇處將冰醋酸注入胃黏膜下層。注射后，胃壁表面立即形成一個圓形或橢圓形的隆起，然后該處變?yōu)橐蝗榘咨煌该鲄^(qū)，直徑約5mm。將大網(wǎng)膜覆蓋于注射區(qū)后，逐層縫合腹壁切口。

取材方法

取材前禁食12h，不限飲水。動物用3%戊巴比妥鈉麻醉后，迅速開胸，主動脈插管，剪開右心耳，首先灌注生理鹽水100mL，繼之灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液()250mL，維持20min。在手術(shù)后1、2、4、6、10和14d分批取胃前壁近胃竇處(每個時間點(diǎn)6只)，沿胃大彎剪開大鼠胃壁，PBS液沖洗干凈后平鋪，將潰瘍邊緣勾畫在玻璃紙上，以便用每小方格1mm×1mm的坐標(biāo)紙估算潰瘍面積。剪取潰瘍旁約3mm×5mm的組織條，置于Bouins液中，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚6μm，裱貼于涂有APES的載片，行免疫組化染色。

免疫組化染色

采用免疫組織化學(xué)SP法，DAB染色。兔抗人TFF3多克隆抗體(工作濃度為1∶100)，SP試劑盒，枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液、DAB染色劑分別購自武漢博士德生物工程公司及福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。切片染色前根據(jù)抗體要求行枸櫞酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)。余具體操作過程按試劑盒說明書完成，并設(shè)立陽性對照(公司提供)和陰性對照(以PBS緩沖液代替一抗)，在光鏡下觀察陽性反應(yīng)呈棕黃色。

觀察

用OLYMPUSCX31顯微鏡連接MiE顯微圖像處理軟件在計算機(jī)上進(jìn)行觀察：①TFF3的判斷標(biāo)準(zhǔn)：以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞，每只動物隨機(jī)選擇10個高倍視野，計數(shù)總細(xì)胞數(shù)以及陽性細(xì)胞數(shù)，并計算陽性細(xì)胞率。以10%陽性細(xì)胞為陽性，10%為陰性;②用成像系統(tǒng)在顯微鏡下隨機(jī)圈定面積，在高倍鏡下計數(shù)所選區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)，通過計算陽性細(xì)胞的數(shù)密度對不同部位胃黏膜進(jìn)行統(tǒng)計分析;③陽性細(xì)胞數(shù)密度(Thenumericaldensitiesonarea，NA)=TFF3陽性細(xì)胞數(shù)目/所選胃黏膜面積。

統(tǒng)計學(xué)處理

以上所得數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用(x±s)表示。胃潰瘍不同部位的數(shù)密度比較用ANOVA方差分析。以為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

制模后的潰瘍面觀察

制模術(shù)后1d，潰瘍組大鼠胃體前壁即可見一個直徑3～6mm的潰瘍，潰瘍呈圓形或橢圓形，中心顏色蒼白，邊界清楚，周圍黏膜充血水腫。術(shù)后2d潰瘍最為明顯，潰瘍中心可見灰白色苔膜。術(shù)后4d潰瘍周圍邊界清晰，黏膜不再充血水腫，呈典型的龕形潰瘍，90%以上為穿孔性潰瘍，周圍大網(wǎng)膜和肝臟粘連包裹形成潰瘍底。隨后進(jìn)入愈合階段，潰瘍面積逐漸減小。至14d左右潰瘍直徑在1～2mm，有的已經(jīng)接近完全愈合。光鏡下觀察，術(shù)后2d壞死黏膜脫落形成明顯潰瘍，黏膜腺體消失，炎性細(xì)胞浸潤;4d可見上皮細(xì)胞向潰瘍中心移行;6d潰瘍邊緣可見新形成的擴(kuò)張腺體;14d后潰瘍處胃壁結(jié)構(gòu)逐漸完成再生，有的黏膜及黏膜下層近似正常。

胃黏膜TFF3的染色情況

TFF3染色主要在胞漿(見圖1～圖2)，胃潰瘍損傷后大鼠胃黏膜TFF3的總體陽性表達(dá)率為%(23/36)。

距潰瘍不同部位胃黏膜TFF3表達(dá)的數(shù)密度比較

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，潰瘍周邊部位及遠(yuǎn)離潰瘍部位大鼠的胃黏膜不僅在例數(shù)上表達(dá)TFF3差異有顯著性，而且在數(shù)密度上差異也有統(tǒng)計學(xué)意義()(見表1，圖3～4)。其中，潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度從大鼠胃潰瘍損傷后的第2天開始到損傷后的第6天呈遞增趨勢，且顯著高于對應(yīng)時期的遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位();而損傷后的第1天以及第10天以后，潰瘍周邊部位TFF3的數(shù)密度與遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位差異沒有顯著性意義()。表1潰瘍自愈期間不同部位TFF3陽性細(xì)胞數(shù)密度變化注：與對照組(遠(yuǎn)離潰瘍組)相比**

距潰瘍不同部位胃黏膜TFF3隨損傷時間的改變

通過統(tǒng)計分析我們發(fā)現(xiàn)，潰瘍周邊細(xì)胞TFF3的改變與損傷后發(fā)生的時間呈負(fù)相關(guān)(,r=-);而遠(yuǎn)離潰瘍部位細(xì)胞TFF3的改變與損傷后的時間不具有相關(guān)性(見表2，圖5)。表2距潰瘍不同部位TFF3的改變與損傷時間的關(guān)系注：與對照組(遠(yuǎn)離潰瘍組)相比*

3討論

TFF3是最近發(fā)現(xiàn)的三葉肽家族成員之一，目前的研究認(rèn)為，TFF3主要在小腸及結(jié)腸杯狀細(xì)胞中表達(dá)，在人子宮、正常乳腺、下丘腦、垂體、肺等組織中的低水平表達(dá)亦有報道。對于TFF3在胃黏膜的表達(dá)情況，目前公認(rèn)的是在人胃黏膜不表達(dá)TFF3，但在胃潰瘍及胃癌中都有其高表達(dá)的報道。

關(guān)于TFF3在距潰瘍不同部位表達(dá)情況的差異，早在1990年Wright等發(fā)現(xiàn)在慢性潰瘍附近區(qū)域存在一個特有的解剖結(jié)構(gòu)即潰瘍相關(guān)細(xì)胞系(UACL)。在消化性潰瘍以及潰瘍性結(jié)腸炎時會出現(xiàn)UACL。UACL是一種腺樣結(jié)構(gòu)，直接來源于腸腺隱窩基部干細(xì)胞群。UACL可以不斷地產(chǎn)生新的細(xì)胞并遷移到潰瘍表面，促進(jìn)潰瘍修復(fù)。UACL表達(dá)已知的三種TFF以及EGF、TGFα。這些因子出現(xiàn)的先后順序存在一定爭議，早期研究發(fā)現(xiàn)UACL首先表達(dá)EGF和TGFα，再刺激鄰近的細(xì)胞表達(dá)TFF。近期實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型研究表明，首先在黏膜損傷30min至2hTTF2mRNA表達(dá)達(dá)到高峰，12h后降至正常水平;接著第2天再表達(dá)TTF3mRNA，第3天達(dá)高峰，隨后逐漸下降，損傷后10d降至近正常水平，最后為EGF和TGFα。因此推斷，與EGF和TGFα相比，TFF的表達(dá)可能是對損傷的早期快速反應(yīng)。我們的研究結(jié)果表明，潰瘍周邊部為TFF3的表達(dá)要顯著強(qiáng)于遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位()，與上述的研究結(jié)果相符。同時，從大鼠胃潰瘍損傷后的第2天開始到損傷后的第6天，潰瘍周邊部位TFF3的表達(dá)均顯著強(qiáng)于遠(yuǎn)離潰瘍的其它部位();而損傷后的第1天以及10d之后，胃體各部位TFF3的表達(dá)差異沒有顯著性意義()。這一結(jié)果不僅印證了TFF3并不是開始就存在于正常胃黏膜當(dāng)中，而是當(dāng)出現(xiàn)了潰瘍損傷后伴隨著損傷黏膜的修復(fù)其開始表達(dá)并逐漸增多的，而且在潰瘍周邊部位TFF3表達(dá)更強(qiáng)一些，同樣印證了其參與修復(fù)受損黏膜的作用。而隨著損傷黏膜的逐漸恢復(fù)，TFF3的表達(dá)含量又逐漸降低，且在距潰瘍的各個部位其表達(dá)含量沒有顯著性差異，也與上述推論相一致。

有研究結(jié)果證明，三葉肽可增強(qiáng)受損黏膜周圍完好的上皮細(xì)胞向損傷黏膜表面遷移覆蓋，促進(jìn)損傷黏膜的重建。通過統(tǒng)計分析我們發(fā)現(xiàn)，潰瘍周邊細(xì)胞TFF3的改變與損傷后發(fā)生的時間呈負(fù)相關(guān)(,r=-);而遠(yuǎn)離潰瘍部位細(xì)胞TFF3的改變與損傷后的時間不具有相關(guān)性，與上述研究結(jié)果相符。但從趨勢上，我們的結(jié)果表明在制模后的第1天，遠(yuǎn)離潰瘍部位細(xì)胞TFF3的表達(dá)要略高一些，說明雖然沒有冰醋酸造成的潰瘍形成，但是經(jīng)過手術(shù)后，大鼠胃黏膜的其它部位也造成了損傷，TFF3的表達(dá)增高可能也與這部分黏膜的修復(fù)相關(guān)。

相關(guān)報道還表明，在部分腫瘤組織如皮膚粘液癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌等中可見TFF3表達(dá)上調(diào)[5，8，9]，因此，TFF3不僅在黏膜保護(hù)及修復(fù)過程中發(fā)揮了重要的作用，而且在腫瘤診治等方面也有深刻的意義。進(jìn)一步深入探討TFF家族特別是TFF3的作用機(jī)理必將對于黏膜保護(hù)、潰瘍治療及腫瘤治療等方面有重大意義。

【參考文獻(xiàn)】

1LinJ,NadrooAM,ChenW,etandprenatalexpressionoftrefoilfactor3/ITFinthehumanintestine[J].EarlyHumDev,2003,71:103

2SuemoriS,LynchDevaneyK,Podolskyandcharacterizationofratintestinaltrefoilfactor:tissueandcellspecificmemberofthetrefoilproteinfamily[J].ProcNatlAcadSciUSA,1991,88(24):1101711021

3李兆申，湛先保，許國銘.胃黏膜損傷與保護(hù)：基礎(chǔ)與臨床[M].上海：上?？萍汲霭嫔?，

4AlisonMR,ChineryR,PoulsomR,etulcerationleadstosequentialexpressionofspasmolyticpolypeptide,intestinalpolypeptide,intestinaltrefoilfactorandtransforminggrowthfactoralphamRNAinratstomach[J].JPathol,1995,175(4):405

5EungWK，YuJ，ChanFK，etoftrefoilpeptides(TFF1，TFF2，andTFF3)ingastriccarcinomas,intestinalmetaplasia,andnonneoplasticgastrictissue[J].JPathol，2002，197(5):582

6WrightNA，PikeC，Eliaofano