病原菌的分離鑒定及其疫苗的制備

一、 實驗目的熟悉水產(chǎn)細菌性病原的分離、培養(yǎng)、純化與鑒定的基本方法，了解所分離細菌性病原的形態(tài)特征及培養(yǎng)特點，了解細菌性滅活疫苗制備的基本過程。二、 實驗材料患白內(nèi)障病虎紋蛙（或其他患細菌性疾病的水產(chǎn)動物）、健康虎紋蛙、腦膜炎敗血黃桿菌（虎紋蛙白內(nèi)障病的病原）三、 實驗藥品、用具2216E瓊脂平板、2216E瓊脂斜面、福爾馬林、無菌蒸餾水、生理鹽水、磷酸緩沖液、接種環(huán)、解剖刀、剪刀、鑷子、滴管、紗布、白瓷盤、酒精棉球、滅菌試管、96孔板、注射器、酒精燈、離心機（包括離心管）、水族箱、記號筆四、 實驗操作程序（一）病原菌的分離與鑒定.培養(yǎng)基的制備（1）普通肉湯培養(yǎng)基：按以下劑量稱取各種試劑（先稱取鹽類再稱蛋白胨及牛肉膏），置于鋁鍋或搪瓷缸中。牛肉膏5g磷酸氫二鉀1g蛋白胨10g蒸餾水1000ml氯化鈉5gpH7.4?7.6初配好的培養(yǎng)基呈酸性故要用NaOH調(diào)整。將pH測定后的肉湯培養(yǎng)基用濾紙過濾，將過濾好的肉湯分裝試管、鹽水瓶、三角燒瓶等容器，待滅菌。（2）普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基普通肉湯1000ml瓊脂20g瓊脂是由海藻中提取得一種多糖類物質(zhì)，對病原性細菌無營養(yǎng)作用，但在水中加溫可融化，冷卻后可凝固。在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂1.5?2%即可固定培養(yǎng)基，如加入0.3?0.5%則成半固體培養(yǎng)基。將稱好的瓊脂加到普容肉湯中，加熱煮沸，待瓊脂完全融化后，將pH調(diào)至7.4?7.6。瓊脂融化過程中需不斷攪拌，并控制火力，不使培養(yǎng)基溢出或燒焦，并注意補充蒸發(fā)掉的水份。加熱溶解好的培養(yǎng)基可用濾紙進行過濾，固體培養(yǎng)基要用4層紗布趁熱過濾(切勿使培養(yǎng)基凝固在紗布上)，之后按實驗要求，將配制好的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶中，包扎好待滅菌，將培養(yǎng)基置于高壓蒸汽鍋內(nèi)，121°C滅菌15?30min，趁熱將試管口一端擱在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通瓊脂斜面，也可直立，凝固后即成高層瓊脂。鹽水瓶中的普通瓊脂以手掌感觸，若將瓶緊握手中覺得燙手，但仍能握持者，此即為傾倒平皿的合適溫度(50?60C)，每只滅菌培養(yǎng)皿倒入約15?20ml，將皿蓋蓋上，并將培養(yǎng)皿于桌面上輕輕回轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基平鋪于皿底，即成普通瓊脂平板。培養(yǎng)基中的某種成分，如血清、糖類、尿素、氨基酸等在高溫下易于分解、變性，故應過濾除菌，再按規(guī)定的量加入培養(yǎng)基中。.病原菌的分離與培養(yǎng)分離病原菌的材料要求是具有典型患病癥狀的活的或剛死不久的患病生物，病原菌的分離方法如下。體表分離：先將病灶部位表面用70%酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用經(jīng)酒精燈灼燒的解剖刀燙燒消毒，再用接種環(huán)刮取病灶深部組織或直接挑取部分深部患病組織，接種于普通肉湯培養(yǎng)基增菌或直接在普通瓊脂平板上劃線分離。內(nèi)部組織器官：用70%酒精浸過的紗布覆蓋體表或用酒精棉球擦拭，進行體表消毒，無菌打開病魚的腹腔，以肝、腸、心臟等臟器為材料，先將擬分離病原的部位表面用70%酒精棉球擦拭或用經(jīng)火焰上灼燒后的解剖刀燙燒，以殺死表面的雜菌，隨即在燒灼部位刺一小孔，用滅菌的接種環(huán)（待冷2?5秒）伸向燒灼部小洞中，用手指將接種環(huán)輕輕旋轉(zhuǎn)兩次，借以達到取足材料的目的。左手持握普通瓊脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接種環(huán)在瓊脂平板上分區(qū)劃線接種。劃線時接種環(huán)面與平板表面成30?40度的角輕輕接觸，在平板表面輕快地移動，接種環(huán)不應嵌入培養(yǎng)基內(nèi)，且不要重復，否則形成菌苔。劃線完畢，蓋上皿蓋，接種環(huán)滅菌后放下，并在平皿底部用記號筆注明接種材料、日期及操作者代號。也可對實質(zhì)性臟器用無菌剪刀下一小塊，用鑷子夾住病料使其剖面接觸潔凈的玻片，作多個觸片，染色后在顯微鏡下直接鏡檢，能快速獲得結(jié)果。鰓部：用無菌接種環(huán)刮取鰓上的分泌物劃平板。血液及體液：用無菌注射器吸取病魚血液和體液，滴于平板涂布；或用滅菌后的接種環(huán)挑取血液和體液后于平板上劃線，分離細菌。接種后的平板經(jīng)30°C左右培養(yǎng)24?72h后，檢查菌落生長情況，對菌落檢查的主要內(nèi)容包括：（1）大?。浩浯笮∫詍m表示，微小菌落：針尖大，直徑小于0.5mm，如支原體菌落、豬丹毒桿菌菌落；小菌落：直徑在0.5?1mm之間，如嗜血桿菌、布氏桿菌菌落；中等大小的菌落：直徑在1?3mm之間，如巴氏桿菌、沙門氏桿菌菌落；大的菌落：直徑大于3mm，如炭疽芽孢桿菌菌落等。（2）形態(tài)：圓形，不規(guī)則形（根狀、樹葉狀）（3）邊緣：整齊，不整齊（鋸齒狀、蟲蝕狀、卷發(fā)狀）（4）表面：光滑、粘液狀、粗糙、荷包蛋狀、漩渦狀、顆粒狀（5）隆起度：隆起，輕度隆起，中央隆起，平升狀、扁平狀，臍狀（凹陷狀）（6）顏色：無色、灰白色、白色、金黃色、紅色、粉紅色（7）透明度：透明、半透明、不透明（8）溶血性：p一溶血（完全溶血），a一溶血（不完全溶血），不溶血根據(jù)菌落數(shù)量和特征，挑選可能的病原菌菌落進一步劃線純化1?2次后，將經(jīng)純化的可能病原菌用于感染試驗。.病原菌的確定將從患病材料中分離的所有可能病原菌經(jīng)純化和擴大培養(yǎng)后分別進行人工感染實驗。目前最常用的人工感染接種方法有浸泡、口服和注射法等，究竟選用哪一種方法最合適，需要根據(jù)不同的疾病類型和可能的侵入途徑而定。如體表的病，可采用浸泡法（包括創(chuàng)傷浸泡）；體內(nèi)的疾病，可采用口服、注射法。由于絕大部分病原菌都是條件致病菌，因此在人工感染實驗時還要注意感染菌的用量，接種量過大，即使該菌并不是引起實驗材料致病的病原菌，也可能會因大量菌體裂解釋放的大量內(nèi)毒素而使感染生物死亡，為了量化感染菌的危害程度，可以測定感染細菌對接種動物的半數(shù)致死量（LD50），根據(jù)LD50的大小來判斷其致病力的強弱。只有LD50相對較低、感染引起的死亡與實驗材料有相同癥狀、并且經(jīng)回接實驗還能分離到相同的細菌時，才能確定所分離的細菌為引起實驗材料致病的病原。在感染實驗時，感染對象要求是沒有患病史的同種生物，在感染前要經(jīng)過1?2周的暫養(yǎng)，感染數(shù)量要30尾以上（至少要10尾以上）。必要時，還要將溫度控制在適合疾病爆發(fā)的水平。感染過程中要定時投餌和換水，同時安排合適的對照組。.病原菌的鑒定分別觀察病原菌的形態(tài)以及檢測其各種生理生化指標，通過查閱伯杰氏手冊確定病原菌的種類；也可直接用細菌鑒定儀測定病原菌的種類。（二）疫苗制備.病原菌的擴大培養(yǎng)與分離液體培養(yǎng)：按配方配制2216E液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基用三角燒瓶分裝并蓋上棉塞后置于高壓蒸汽鍋內(nèi)，121°C滅菌15?30min，冷卻后于超凈工作臺內(nèi)加入1ml左右預先制備的病原菌菌液，蓋上棉塞，用搖床于28~30C下震蕩（約150rpm）培養(yǎng)24~48h。病原菌經(jīng)擴大培養(yǎng)后以3000~5000rpm離心20~30min，取沉淀用PBS（磷酸緩沖液）配制成1%或1%。左右的菌懸液。茄子瓶擴大培養(yǎng)：按配方配制2216E瓊脂培養(yǎng)基，于高壓蒸汽鍋內(nèi)，121C滅菌15?30min，趁熱倒入經(jīng)干熱消毒的茄子瓶內(nèi)（每瓶約15ml培養(yǎng)基），茄子瓶用消毒棉塞封口后平放于超凈工作臺臺面，稍予搖動使培養(yǎng)基平鋪于瓶壁，冷卻后制成茄子瓶平板。用無菌滴管吸取預先制備的病原菌菌液，在每個茄子瓶平板表面滴加3~4滴，再用經(jīng)灼燒消毒并冷卻的玻璃涂布器將菌液涂布均勻，28-30C下培養(yǎng)24~48h。用無菌PBS洗脫平板表面的菌苔，洗脫液經(jīng)3000~5000rpm離心20~30min，取沉淀用PBS（磷酸緩沖液）配制成約1%或1%的菌懸液。.滅活化學滅活：以福爾馬林作為化學滅活劑。滅活前先確定福爾馬林對該病原菌的安全滅活濃度，確定方法為：取7支滅菌試管，分別5ml加入預先制備病原菌菌液，其中6支裝有菌液的試管分別依次加入一定量的福爾馬林，使福爾馬林的終濃度分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，另1支試管不加入福爾馬林作為對照；于4°C下放置24h后，于每支試管中分別取0.2ml菌液于2216E瓊脂平板上涂布，28-30C下培養(yǎng)48h，檢測各試管內(nèi)細菌的存活情況，只有沒有細菌生長的對應福爾馬林濃度才是該病原菌的滅活安全濃度。向第1步中制備的1%菌懸液內(nèi)添加福爾馬林，使福爾馬林的最終濃度達到安全滅活濃度以上，于4C下放置24h，制備滅活菌液。其他滅活方法：除化學滅活，疫苗制備時還可采用熱滅活、紫外線和超聲波滅活等方法。.安全性檢測活性檢測：取0.2ml滅活菌于2216E瓊脂平板上涂布，28-30C下培養(yǎng)48h，只有在瓊脂平板上沒有出現(xiàn)菌落出現(xiàn)才說明滅活徹底，滅活菌液中確實沒有活菌存在。安全檢測：將所制備的滅活菌液稀釋成疫苗接種所用的濃度（一般為108cfu），用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到無患病史的同種寄主動物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動物）體內(nèi)，經(jīng)20d觀察無發(fā)病或死亡才說明該滅活細菌是安全的。.效果檢測抗體效價檢測：用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到無患病史的同種寄主動物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動物）體內(nèi)，連續(xù)養(yǎng)殖2個月，從第10d開始每隔10d取3尾以上接種生物用微量血凝板法檢測其平均凝集抗體效價。抗體效價檢測方法為：抽取感染動物血液并離心分離血清，用取樣器吸取0.1ml血清加入經(jīng)滅菌的96孔板的A1孔內(nèi)，在96孔板A行的其他孔內(nèi)加入0.05ml無菌PBS，從A1孔內(nèi)取0.05ml血清加入A2孔內(nèi)，混勻后再從A2孔內(nèi)取0.05ml液體加入A3孔內(nèi)……，如此重復，使96孔板內(nèi)后1個孔內(nèi)的血清濃度均比前1個孔低1倍（倍釋法），再在96孔板的每個孔內(nèi)加入0.05ml菌液（活的或滅活的均可），37C孵育過夜后觀察（最好在96孔板下墊一張黑紙以增加反差），出現(xiàn)沉淀的最高血清稀釋倍數(shù)即為血清中所含抗病原菌抗體的效價。比較不同時期內(nèi)抗體效價的變化情況，確定最高抗體效價值。一般情況下，抗體效價越高，滅活細菌作為疫苗的效果就最好。攻毒感染實驗：選擇無患病史的同種同齡寄主動物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動物）作為感染對象，用注射法進行攻毒感染。用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到無患病史的同種寄主動物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動物）體內(nèi)，連續(xù)養(yǎng)殖2個月，從第20d開始每隔20d取10尾以上接種生物用活的病原菌進行感染，感染方法為。（二）致病菌的人工感染1）實驗材料：嗜水氣單胞菌斜面（每組2支），試管架（1個）酒精棉球（1瓶），無菌生理鹽水，滅菌空試管，麥氏比濁管。2）實驗方法：用裝有針頭的注射器（或無菌吸管），吸取無菌生理鹽水，滴注到培養(yǎng)有嗜水氣單胞菌的斜面上，振蕩使斜