動物細胞與組織培養(yǎng)成體干細胞

動物細胞與組織培養(yǎng)成體干細胞第一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五一、概論20世紀初，Pappenheim等首次提出了成體干細胞的概念。胚胎干細胞繼續(xù)進行分化，形成具有特定功能的干細胞，這些專門化的干細胞統(tǒng)稱多能干細胞。在胎兒、兒童和成人組織中存在的多能干細胞統(tǒng)稱“成體干細胞（Adultstemcell）”。如血液干細胞可分化成白細胞、紅細胞和血小板;皮膚干細胞可形成各種不同類型的皮膚細胞。第二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

成體干細胞是指一群分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新、并負有構建和補充某種組織的各種類型細胞潛能的干細胞

1997年Wilmut用體外培養(yǎng)的、高度分化的母羊乳腺細胞核移植入去核卵細胞，克隆出了新綿羊“Dolly”克隆羊的誕生表明：高度分化的體細胞仍具有完整的遺傳信息，能重新編排發(fā)育程序，指導胚胎發(fā)育成為一個完整的新個體。

第三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五成體干細胞具有跨越組織或胚層分化的特性稱為成體干細胞的可塑性或橫向分化

2001年斯坦福大學的Blau博士等人對成體干細胞提出了一個全新的概念：成體干細胞是來自許多不同類型細胞（包括已分化細胞）的一種“狀態(tài)”，這類細胞不僅存在特定組織中，還可通過血液到達軀體的各個部分，參與各種組織的再生和修復第四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五成體干細胞是一種處于尚未分化的、處于干細胞/祖細胞/前體細胞狀態(tài)的成體細胞，它來源于成年和未成年個體的組織干細胞。在正常生理條件下，它傾向于更新、并分化為所在特定組織的若干種細胞。但在特殊條件誘導下，成體干細胞能超越特定組織、分化呈其他組織的功能性細胞，參與其他損傷組織的修復第五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

最近幾年的研究表明，這些干細胞的分化能力遠超過傳統(tǒng)觀點局限的范圍。例如骨髓成體干細胞在合適的體內外環(huán)境中可長期生長，也可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、骨髓基質細胞及多種血管內皮細胞。還可形成一種肝臟前體細胞－肝卵園細胞，神經(jīng)、膠質細胞和心肌細胞。高度純化的造血干細胞可分化形成肝細胞、內皮細胞和心肌細胞；骨骼肌細胞能分化出造血細胞；中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細胞可形成血液細胞、肌肉和許多其它體細胞。

成體干細胞這種跨系統(tǒng)分化特性稱為“可塑性（Plasticity）”。

第六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五二、成體干細胞的可塑性1、骨髓干細胞各種血細胞內皮細胞脂肪細胞成纖維細胞HSC和MSC的分化全能具有很大的可塑性，可分化為甚至跨越胚層的各種類型細胞，如神經(jīng)細胞、軟骨細胞，骨細胞，干細胞、肌肉細胞等不同類型的細胞間質干細胞（MSC）造血干細胞（HSC）骨髓干細胞第七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五a.間質干細胞間質干細胞在體外培養(yǎng)時，可分化為內皮細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、骨細胞、肌肉等細胞的潛能MSC細胞在異常環(huán)境中，細胞分化的可塑性增加第八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五b.造血干細胞

造血干細胞是體內各種血細胞的唯一來源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。HSC表面存在一些標志，可用流式細胞儀和免疫磁性分選技術從骨髓細胞中分離和純化出HSC。HSC移植到不同的環(huán)境可分化為各種不同類型細胞。

造血干細胞的移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性和轉移性惡性腫瘤疾病的最有效方法。

第九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五神經(jīng)干細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中一類能自我更新、并產生神經(jīng)原和神經(jīng)膠質細胞的前體細胞

2、神經(jīng)干細胞神經(jīng)干細胞等只能向一種類型或密切相關的兩種類型的細胞分化。說明成體干細胞的分化潛能已經(jīng)受到一定限制。第十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五神經(jīng)干細胞移植發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞的潛能具有發(fā)育的依賴性，說明神經(jīng)干細胞的分化潛能已受到一定的限制。但體外培養(yǎng)移植試驗表明在一定的為環(huán)境下仍有可塑性。

1999年Bjounson將神經(jīng)干細胞分化成造血細胞。開創(chuàng)了成體干細胞跨越組織和胚層分化研究的先例。神經(jīng)干細胞的可塑性第十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

神經(jīng)干細胞的分布

神經(jīng)管形成以前,在整個神經(jīng)板檢測到神經(jīng)干細胞的選擇性標記物神經(jīng)巢蛋白(nestin),是細胞的骨架蛋白。神經(jīng)干細胞主要存在于神經(jīng)發(fā)生區(qū)：海馬回和次腦室區(qū),此外，成年嗅球、皮層、室管膜層或者室管膜下層、紋狀體、海馬的齒狀回顆粒細胞下層等腦組織中分布著神經(jīng)干細胞。研究發(fā)現(xiàn)脊髓、隔區(qū)也分離出神經(jīng)干細胞脊髓損傷時,來自于神經(jīng)干細胞的神經(jīng)元新生受到抑制,而神經(jīng)膠質細胞明顯增多,其機制可能與生成神經(jīng)元的微環(huán)境有關。第十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、肝干細胞1958年Wilson等認為肝組織中存在著干細胞，因為肝組織均有營養(yǎng)損傷和部分切除時再生能力。肝卵圓細胞能在體外大量增值，細胞移植后可分化為肝細胞和膽管上皮細胞，表明肝卵圓細胞是肝干細胞。第十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五肝干細胞的可塑性肝干細胞移植到胰腺和十二指腸時可分化胰腺細胞和腸上皮細胞，表明肝干細胞在適當?shù)奈h(huán)境中能被誘導分化為內胚層的其他組織細胞。丁酸鈉或二甲亞砜可誘導肝干細胞分化為肝細胞轉化生長因子（TGF-bata）或肝細胞生長因子（HGF）可誘導肝干細胞分化為膽上皮細胞第十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五4、骨骼肌干細胞肌肉的生長、更新和修復是由肌纖維周圍的衛(wèi)星細胞介導的——即骨骼肌干細胞骨骼肌干細胞不僅可分化為肌肉，而且可分化為血液細胞成分。具有分化的可塑性第十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五四、成體干細胞的體外培養(yǎng)和特性1、骨髓間質干細胞半世紀來造血干細胞移植治療血液病、自身免疫病和遺傳疾病取得矚目的進展。間質干細胞（MSC）能向軟骨、骨、脂肪、造血基質和神經(jīng)原樣等細胞分化。使其首選為組織工程中的種子細胞。MSC主要來源于骨髓，還可來源于脂肪組織吸取物（PLA）第十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、造血干細胞造血干細胞來源于胚胎期的肝臟和骨髓。全能造血干細胞可分化為多能淋巴干細胞和髓性造血干細胞全能造血干細胞造血祖細胞造血前體細胞判斷造血干細胞通常用體內間接法。脾臟中造血灶稱為集落形成單位（CFU）造血干細胞的表面抗原CD34為強陽性第十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、神經(jīng)干細胞神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)和建系，必須滿足兩個基本條件：1.具有永生化特性2.具有神經(jīng)干細胞世系遺傳明顯特性，即神經(jīng)干細胞表型。第十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

神經(jīng)干細胞的特點

①神經(jīng)干細胞可以分化②通過分裂產生相同的神經(jīng)干細胞來維持自身的存在,同時,也能產生子細胞并進一步分化成各種成熟細胞③神經(jīng)干細胞通過兩種方式生長,一種是對稱分裂,形成兩個相同的神經(jīng)干細胞;另一種是非對稱分裂,由于細胞質中的調節(jié)分化蛋白不均勻的分配,使得一個子細胞不可逆的走向分化的終端而成為功能專一的分化細胞,另一個子細胞則保持親代的特征,仍作為神經(jīng)干細胞保留下來。分化細胞的數(shù)目受分化前干細胞的數(shù)目和分裂次數(shù)控制。第十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五神經(jīng)干細胞

由于分離神經(jīng)干細胞所需的胎兒腦組織較難取材，加之胚胎細胞研究的爭議尚未平息，神經(jīng)干細胞的研究仍處于初級階段。理論上講，任何一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病都可歸結為神經(jīng)干細胞功能的紊亂。腦和脊髓由于血腦屏障的存在使之在干細胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)后不會產生免疫排斥反應。如：給帕金森氏綜合癥患者的腦內移植含有多巴胺生成細胞的神經(jīng)干細胞，可治愈部分患者癥狀。第二十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五五、成體干細胞研究中的問題1、異質性可塑性可能是由于混雜的幾種和不同類干細胞分化的結果一些干細胞可塑性使用，人們質疑所謂“可塑性”可能是混雜幾種或一群不同類型干細胞分化的結果干細胞的異質性在遺傳學種是指由于不同遺傳機制而產生的相同或類似的表現(xiàn)型異質性在某種程度上是干細胞固有的特性。第二十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、干細胞所處環(huán)境干細胞所處的環(huán)境對于干細胞的分化命運有著重要影響。干細胞所處的環(huán)境之間精巧而默契的協(xié)調作用可能是干細胞“可塑性”的重要原因第二十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五對于干細胞“可塑性”現(xiàn)象的解釋有4種：1）機體有多種來源和不同分化方向的成體干細胞群體，能分布定向的向各自來源的細胞分化2）機體存在多潛能成體干細胞，微環(huán)境導致不同分化方向3）特定組織來源的成體干細胞除分化為特定組織細胞外，可重新編程，分化為其他細胞。4）某種成體干細胞與特定組織來源的干細胞發(fā)生融合，產生“雜交細胞”，獲得向后者分化潛能?？伤苄缘恼{控受外源性因素和內源性因子調控3、可塑性的調控第二十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五4、分化細胞的功能可塑性研究的結果大多是基于檢測新生組織的特定蛋白或標志物，很少檢測分化細胞的功能，但有限不同細胞具有相同的標志物。欲提供干細胞的終末分還狀態(tài)，應基于細胞表面標志鑒別和細胞功能證明兩方面的依據(jù)。如神經(jīng)細胞移植后，可塑為血細胞，即要檢測起表面標志，又要檢測其造血的功能。第二十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五5、體外增殖成體干細胞分離后，目前尚無有效的能較長期在體外維持未分化狀態(tài)并大量增殖的體外培養(yǎng)方法。常用的手段：1）分離的干細胞直接移植入動物或病人2）體外將干細胞誘導分化為所需的成熟細胞，隨后進行移植。如皮膚干細胞移植到燙傷病人，雖可愈合，但不能產生汗腺。第二十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五六、成體干細胞在再生醫(yī)學中的應用在醫(yī)學中，可利用成體干細胞于創(chuàng)傷修復、疾病的細胞治療、整形外科學和組織工程學等需要組織工程的核心是由種子細胞和生物活性材料構成三維空間復合體具有足夠數(shù)量并保持特定生物學活性的重組細胞是組織工程最基本的要素。第二十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五通過組織工程構建的組織，不僅能對病損組織進行形態(tài)、結構和功能的重建并達到永久性替代的目的，而且還可以隨著身體生長的變化而一同變化。第二十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五1、組織工程化皮膚完全克隆是皮膚真正的干細胞，具有超常的自我更新能力，可被作為皮膚移植的種子細胞，且P63蛋白是角質細胞干細胞的標志物第二十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、組織化骨骼骨骼涉及三維立體結構，所需組織包括骨、軟骨、脂肪、血發(fā)生支持基質等。必須由適當?shù)纳锘钚圆牧蠘嫿ǔ扇S支架進行培養(yǎng)第二十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、骨髓組織工程骨髓至少含兩類干細胞（HSC和SSC）能產生血管、骨、軟骨、骨骼肌、心肌、肝以及神經(jīng)細胞等在組織工程中常優(yōu)先考慮作為種子細胞來源。優(yōu)點：容易收集，具有明顯的表面標志物第三十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五七、成體干細胞的去向成體干細胞經(jīng)常位于特定的微環(huán)境中。微環(huán)境中的間質細胞能夠產生一系列生長因子或配體，與干細胞相互作用，控制干細胞的去向。或者產生新的干細胞?；蛘甙匆欢ǖ某绦蚍只?，形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。第三十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

（1）細胞內蛋白對干細胞分裂的調控:細胞的結構蛋白，特別是細胞骨架成分對細胞的發(fā)育非常重要。收縮體與紡錘體的結合決定了干細胞分裂的部位。（2）轉錄因子的調控1.內源性調控第三十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2.外源性調控（1）分泌因子

間質細胞能夠分泌許多因子，維持干細胞的增殖，分化和存活。（2）膜蛋白介導的細胞間的相互作用

有些信號是通過細胞-細胞的直接接觸起作用的。（3）整合素與細胞外基質

整合素家族是介導干細胞與細胞外基質粘附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細胞的非分化增殖提供了適當?shù)奈h(huán)境。第三十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五八、成體干細胞優(yōu)勢1、成體干細胞可從患者自身獲得，而不存在組織相容性的問題，治療時可避免長期應用免疫抑制劑對患者的傷害。胚胎干細胞免疫排斥，因此要對患者進行長期免疫抑制劑治療或將患者的造血系統(tǒng)和外來細胞形成嵌合體。治療性克?。簩⒒颊叩捏w細胞核移植到去核的健康供體卵細胞中，在體外克隆并隨后發(fā)育分化產生攜帶患者自己MHC的胚胎干細胞。胚胎干細胞發(fā)育分化過程中極高的非整倍體發(fā)生率。體細胞克隆所需的卵細胞難以獲得。第三十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

2、胚胎干細胞能分化成各種細胞類型，但這種分化是“非定位性”的。當前的做法容易導致畸胎瘤。在應用胚胎干細胞治療前，必須先進行初步的細胞誘導分化，以防止畸胎瘤的發(fā)生。也必須確認胚胎干細胞供者沒有諸如（肌）營養(yǎng)失調癥之類的遺傳性疾病。相對而言，成體干細胞不存在上述問題，例如骨髓移植實驗并不引發(fā)畸胎瘤。第三十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

3、成體干細胞也具有類胚胎干細胞的高度分化能力有科學家提出了成體干細胞研究的新假說，即在人體發(fā)育的過程中，成體干細胞是存留在多種組織中、具有多系分化能力的亞全能干細胞群體，這些細胞都具有相同或相似的細胞表型，在適合的微環(huán)境下可分化成多種組織細胞。成體干細胞移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性和轉移性惡性腫瘤疾病的最有效方法。

第三十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五五、干細胞技術應用

1.疾病治療研究干細胞增殖和分化機制的最終目的是應用干細胞治療疾病。理論上講，干細胞可以用于各種疾病的治療，但其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死，退行性病變如帕金森綜合癥，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病等。第三十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2.體外制造人體器官干細胞和動物工程的結合將有可能解決這一問題。比如通過形成嵌合體，在嚴格的控制下，使動物的某些器官來源于人體干細胞。這些來自人體干細胞的器官可應用于臨床移植治療。第三十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

（1）應用干細胞治療疾病有著廣泛的前景。