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熒光免疫技術(shù)考點(diǎn)總結(jié)第一節(jié)概述熒光免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中進(jìn)展最早的一種。一、熒光的根本學(xué)問(wèn)熒光:某些物質(zhì)受到肯定波長(zhǎng)光的激發(fā)后,在極短時(shí)間內(nèi)放射出的波長(zhǎng)大于激發(fā)光波長(zhǎng)的光。放射光譜:固定激發(fā)光波長(zhǎng)回到的能級(jí)不同,發(fā)出的熒光波長(zhǎng)就不同。激發(fā)光譜:固定檢測(cè)放射光熒光波長(zhǎng),用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照耀樣品所記錄到的相應(yīng)的熒光放射強(qiáng)度譜圖。熒光效率:熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率稱為熒光效率。在肯定范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān),即激發(fā)光越強(qiáng),熒光越強(qiáng),但過(guò)強(qiáng)的激發(fā)光會(huì)使熒光很快褪去。熒光壽命:熒光物質(zhì)被激發(fā)后產(chǎn)生的熒光衰減到肯定程度時(shí)所用的時(shí)間稱為熒光壽命。熒光淬滅:熒光物質(zhì)在某些理化因素〔I-、硝基苯等〕作用下,放射熒光減弱甚至消退,稱為熒光淬滅,這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài),所吸取的能量無(wú)法以熒光的形式放射。熒光偏振。二、熒光物質(zhì)〔一〕熒光色素異硫氰酸熒光素〔FITC〕:呈現(xiàn)光明的黃綠色熒光。四乙基羅丹明〔RB200〕:呈橘紅色熒光。四甲基異硫氰酸羅丹明〔TRITC〕:呈橙紅色熒光。藻紅蛋白〔R-RE〕:呈光明的橙色熒光?!捕称渌麩晒馕镔|(zhì)鑭系螯合物:其中以Eu3+應(yīng)用最廣。Eu3+時(shí)間長(zhǎng),最適合用于時(shí)間區(qū)分熒光免疫測(cè)定。酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì):4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷本身無(wú)熒光,受β-半乳糖苷酶的作用分解成甲基傘酮,后者可發(fā)出熒光。其他如堿性磷酸酶的底物是4-甲基傘酮磷酸鹽,辣根過(guò)氧化物酶的底物是對(duì)羥基苯乙酸等。其次節(jié)熒光抗體技術(shù)一、熒光抗體的制備〔一〕抗體要求提取IgG后再作標(biāo)記。〔二〕熒光素要求異硫氰酸熒光素最常用要求:①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán),與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離,而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于去除;②熒光效率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合后,仍能保持較高的熒光效率;③熒光色澤與背景組織的色澤比照鮮亮;④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì);⑤標(biāo)記方法簡(jiǎn)潔、安全無(wú)毒;⑥與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定,易于保存。〔三〕抗體的熒光素標(biāo)記攪拌法:適用于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記時(shí)間短、熒光素用量少。但易引起較強(qiáng)的非特異性熒光染色。透析法:適用于標(biāo)記樣品量少、蛋白含量低的抗體溶液。此法標(biāo)記比較均勻,非特異染色也較低?!菜摹碂晒馑貥?biāo)記抗體的純化抗體標(biāo)記完成后,還應(yīng)對(duì)標(biāo)記抗體作進(jìn)一步純化,以去除未結(jié)合的游離的熒光素。純化方法可承受透析法或?qū)游龇謩e法?!参濉碂晒饪贵w的鑒定熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率熒光素與蛋白的過(guò)量結(jié)合是非特異熒光著色的來(lái)源之一,而未結(jié)合者有抑制特異性熒光抗體反響的作用。熒光素結(jié)合到蛋白上的量的重要指標(biāo)是熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率〔F/P〕。比值越大,則抗體結(jié)合的熒光素越多,反之則結(jié)合越少。一般用于組織切片F(xiàn)/P=1.5為宜,用于活細(xì)胞染色F/P=2.4抗體效價(jià)可以承受雙向免疫集中試驗(yàn)測(cè)定1g/L抗體效價(jià)>1:16抗體特異性①吸取試驗(yàn):向熒光抗體中參加過(guò)量相應(yīng)抗原反響后,再用于陽(yáng)性標(biāo)本染色,應(yīng)不消滅明顯熒光;②抑制試驗(yàn):陽(yáng)性標(biāo)本先與相應(yīng)未標(biāo)記抗體反響,洗滌后,再加熒光抗體染色,熒光強(qiáng)度應(yīng)受到明顯抑制?!擦碂晒饪贵w的保存防止抗體失活和防止熒光淬滅。小量分裝,-202~3真空枯燥后可長(zhǎng)期保存。稀釋后的抗體不宜長(zhǎng)時(shí)間保存,在41~3天。二、標(biāo)本的制作組織材料可制備成石蠟切片〔較少用〕或冷凍切片。切片要求盡量薄些,以利于抗原抗體接觸和鏡檢。組織標(biāo)本也可制成印片,方法是用洗凈的玻片輕壓組織切面,使玻片粘上1~2細(xì)胞或細(xì)菌可制成涂片,涂片應(yīng)薄而均勻。過(guò)程中應(yīng)保持抗原的完整性,并在操作中不發(fā)生溶解和變性,也不集中至鄰近細(xì)胞或組織間隙中去。三、熒光抗體染色與結(jié)果推斷25~37℃,30分鐘4℃過(guò)夜為宜?!惨弧持苯臃ǎ河锰禺悷晒饪贵w直接滴加于標(biāo)本上。本法操作簡(jiǎn)便,特異性高,非特異熒光染色因素少;缺點(diǎn)是敏感度偏低,需制備特異性的熒光抗體?!捕抽g接法:可用于檢測(cè)抗原和抗體,一般一抗+熒光二抗。靈敏度高,僅需一種熒光抗體?!踩畴p標(biāo)記法:FITC〔四〕熒光抗體染色結(jié)果推斷:在每次試驗(yàn)時(shí)均需設(shè)立試驗(yàn)比照〔陽(yáng)性和陰性比照〕。陽(yáng)性細(xì)胞的顯色分布有胞質(zhì)型、胞核型和膜外表型三種類型。臨床上依據(jù)特異性熒光強(qiáng)度達(dá)“+”〔為熒光較弱但清楚可見(jiàn)〕以上判定為陽(yáng)性。四、熒光顯微鏡的根本構(gòu)造〔了解〕〔一〕光源通常用高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)糇鳛榧ぐl(fā)光源。〔二〕濾光片濾光片分為隔熱濾光片、激發(fā)濾光片和吸取濾光片。觀看FITCBG12,配以吸取濾光片OG4GG9。〔三〕光路分為透射光和落射光兩種形式。〔四〕聚光器聚光器有明視野、暗視野和相差熒光聚光器等。〔五〕鏡頭目鏡有氟處理、消色差和復(fù)消色差三類鏡頭,常用的是消色差鏡頭。第三節(jié)熒光免疫分析的類型定量測(cè)定。一、時(shí)間區(qū)分熒光免疫測(cè)定〔TRFIA〕用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體,用時(shí)間區(qū)分技術(shù)測(cè)量熒光,同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)展信號(hào)區(qū)分。〔一〕根本原理1.時(shí)間區(qū)分正常組織在激發(fā)光照耀下可以發(fā)出肯定波長(zhǎng)的熒光,但該熒光壽命較短〔1~10ns〕,而鑭系元素螯合物的熒光壽命較長(zhǎng)〔10~1000μs〕。故待短壽命背景熒光完全衰變后再測(cè)定鑭系元素離子螯合物的特異性熒光信號(hào)。Stokes位移:激發(fā)光譜和放射光譜的波長(zhǎng)差,假設(shè)Stokes位移小,激發(fā)光譜和放射光譜常有重疊,相互干擾,影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑭系元素位移大。放射光譜和激發(fā)光譜:鑭系元素放射光譜帶較窄,多在613nm±1Onm。利用濾光片只允許此波段的熒光通過(guò),避開(kāi)干擾。熒光標(biāo)記物的相比照活性:比活性是指單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)標(biāo)記分子可被探測(cè)到的信號(hào)量。信號(hào)增加Eu3+標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物在弱堿性溶液中被激發(fā)后的熒光信號(hào)較弱Eu3+從復(fù)合物上完全解離下來(lái),并與另一種螯合劑所螯合,以增加熒光信號(hào)?!捕硺?biāo)記物和標(biāo)記方法標(biāo)記物:多用Eu3+和Tb3+為標(biāo)記物,其中Eu3+最為常用。標(biāo)記方法:鑭系元素離子不能直接與抗原或抗體結(jié)合,需應(yīng)用具有雙功能基團(tuán)的螯合劑,其一端與鑭系元素離子結(jié)合,另一端與抗原或抗體蛋白分子上的氨基結(jié)合?!踩撤椒愋碗p抗夾心法:待檢抗原與固相抗體結(jié)合,再與Eu3+標(biāo)記抗體結(jié)合,在酸性環(huán)境下,復(fù)合物上的Eu3+解340nm固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法:待檢抗原和Eu3+標(biāo)記的抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,熒光強(qiáng)度與待檢抗原成反比。固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法:待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)Eu3+標(biāo)記抗體,熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比?!菜摹撤椒ㄔu(píng)價(jià)1.優(yōu)點(diǎn):靈敏度高;分析范圍寬;標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定,有效使用期長(zhǎng);測(cè)量快速,易自動(dòng)化;無(wú)放射性污染。2.缺點(diǎn):易受環(huán)境、試劑和容器中的鑭系元素離子的污染,使本底增高。二、熒光偏振免疫測(cè)定熒光偏振程度的差異,測(cè)定體液中小分子物質(zhì)的含量。〔一〕根本原理熒光偏振免疫測(cè)定常用異硫氰酸熒光素〔FITC〕標(biāo)記小分子抗原。〔二〕方法評(píng)價(jià)熒光偏振免疫測(cè)定樣品用量少;熒光素標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定,使用壽命長(zhǎng);方法重復(fù)性好;快速,易自動(dòng)化;試劑盒專屬性強(qiáng),適于檢測(cè)小分子和中等分子物質(zhì),不適宜測(cè)定大分子物質(zhì);靈敏度較非均相熒光免疫測(cè)定法低。三、熒光酶免疫測(cè)定利用酶標(biāo)抗體〔抗原〕與待檢抗原〔抗體〕反響,借助酶反響熒光底物,經(jīng)酶促反響生成穩(wěn)定且高效的熒光物質(zhì),通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度確定待檢抗原或抗體的含量?!惨弧掣驹恚阂詨A性磷酸酶〔ALP〕標(biāo)記抗體〔或抗原〕,以固相載體包被抗原〔或抗體〕,堿性4-甲基傘酮磷酸鹽〔4-MUP〕4-MU360nm激發(fā)光的照耀,發(fā)出450nm〔二〕方法類型雙抗體夾心法:固相抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記抗體與待檢抗原反響4-MUP,熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成正比。雙抗原夾心法:用固相抗原和酶標(biāo)記抗原與待檢抗體反響,參加底物進(jìn)展酶促發(fā)光,熒光強(qiáng)度與待檢抗體含量成正比。固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法:待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合定量的酶標(biāo)抗體,參加底物進(jìn)展酶促發(fā)光反響,熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。〔三〕方法評(píng)價(jià)固相熒光酶免疫測(cè)定法,避開(kāi)了血清和其他生物樣品的背景熒光會(huì)干擾。第四節(jié)熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用自身抗體檢測(cè)關(guān)心診斷自身免疫性疾病。病原體檢測(cè)可快速鑒定病原體并可檢測(cè)血清中抗體。免疫病理檢測(cè)可用于組織中免疫球蛋白、補(bǔ)體和抗原抗體復(fù)合物的檢測(cè)及腫瘤組織中腫瘤特異性抗原的鑒定。細(xì)胞外表抗原和受體檢測(cè)流式細(xì)胞分析將游離細(xì)胞作熒光抗體染色后,經(jīng)單色激光照耀后發(fā)出的熒光信號(hào)由熒光檢測(cè)計(jì)檢測(cè)。二、熒光免疫測(cè)定的應(yīng)用時(shí)間區(qū)分熒光免疫測(cè)定:用于蛋白質(zhì)、激素〔肽類激素、甲狀腺激素、類固醇激素等〕、藥物、腫瘤標(biāo)志物、病原體抗原/抗體等測(cè)定。熒光偏振免疫測(cè)定:適用于血清或尿液中小分子物質(zhì)的測(cè)定,如藥物、維生素、激素。熒光酶免疫測(cè)定:可用于多種抗原抗體的檢測(cè),如病毒抗體、細(xì)菌及毒素抗原、激素、腫瘤標(biāo)志物、過(guò)敏原、心肌損傷標(biāo)志物和凝血因子等。實(shí)戰(zhàn)演練臨床中最常用的熒光色素是A.異硫氰酸熒光素B.四乙基羅丹明C.四甲基異硫氰酸羅丹明D.鑭系螯合物E.藻紅蛋白『正確答案』A『答案解析』臨床中最常用的熒光色素是異硫氰酸熒光素〔FITC〕。最早被用作標(biāo)記免疫技術(shù)中標(biāo)記物的是A.酶B.放射性核素C.熒光素D.金顆粒E.化學(xué)發(fā)光劑『正確答案』C『答案解析』最早被用作標(biāo)記免疫技術(shù)中標(biāo)記物的是熒光素。關(guān)于熒光抗體技術(shù)錯(cuò)誤的選項(xiàng)是A.以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體進(jìn)展抗原定位B.只能檢測(cè)針對(duì)抗體的特異性抗原C.即可檢測(cè)抗原又可檢測(cè)抗體D.間接法中熒光抗體是抗抗體E.一種熒光抗體可對(duì)多種抗原進(jìn)展檢測(cè)『正確答案』B『答案解析』熒光抗體技術(shù)是以熒光素標(biāo)記抗體,與切片中組織或細(xì)胞抗原反響,經(jīng)洗滌分別后,在熒光顯微鏡下觀看呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其部位,借此對(duì)組織細(xì)胞抗原進(jìn)展定性和定位檢測(cè),或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)展定性和滴度測(cè)定,此技術(shù)亦稱熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)。熒光酶免疫測(cè)定:可用于多種抗原抗體的檢測(cè)。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體的熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率〔F/P〕值應(yīng)為A.0.5B.1.0C.1.5D.2.0E.2.4『正確答案』C『答案解析』一般用于組織切片的熒光抗體,其F/P=1.5為宜,用于活細(xì)胞染色以F/P=2.4為宜。用于活細(xì)胞染色的熒光抗體的熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率〔F/P〕值應(yīng)為A.0.5B.1.0C.1.5D.2.0E.2.4『正確答案』E『答案解析』用于活細(xì)胞染色以F/P=2.4為宜。在熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)中,熒光素與抗體之間的結(jié)合靠的是A.范德華力B.氫鍵C.離子鍵D.共價(jià)鍵E.靜電引力『正確答案』D『答案解析』在熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)中,熒光素與抗體之間的結(jié)合靠的是共價(jià)鍵。熒光抗體技術(shù)中,臨床上常用的只需一種標(biāo)記抗體即可檢測(cè)多種抗原的方法是A.直接法B.間接法C.補(bǔ)體結(jié)合法D.雙標(biāo)記法E.熒光偏振免疫法『正確答案』B『答案解析』間接法可用于檢測(cè)抗原和抗體。本法有兩種抗體相繼作用,第一抗體為針對(duì)抗原的特異抗體,其次抗體〔熒光抗體〕為針對(duì)第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高,而且在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。用間接法免疫熒光技術(shù)檢測(cè)組織中的抗原,應(yīng)將熒光素標(biāo)記A.抗原B.相應(yīng)抗體C.抗免疫球蛋白抗體D.抗原-抗體復(fù)合物EC3『正確答案』C『答案解析』用間接法免疫熒光技術(shù)檢測(cè)組織中的抗原,應(yīng)將熒光素標(biāo)記抗免疫球蛋白抗體。目前臨床上細(xì)菌菌種鑒定應(yīng)用較多的方法是A.ELISAB.放射免疫技術(shù)C.化學(xué)發(fā)光法D.熒光抗體技術(shù)E.金免疫技術(shù)『正確答案』D『答案解析』目前臨床上細(xì)菌菌種鑒定應(yīng)用較多的方法是熒光抗體技術(shù)。目前流式細(xì)胞技術(shù)中用于細(xì)胞染色應(yīng)用了A.ELISAB.放射免疫技術(shù)C.化學(xué)發(fā)光法D.熒光抗體技術(shù)E.金免疫技術(shù)『正確答案』D『答案解析』熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用:①自身抗體檢測(cè);②病原體檢測(cè);③免疫病理檢測(cè);④細(xì)胞外表抗原和受體檢測(cè);⑤流式細(xì)胞分析。以下有關(guān)制作熒光抗體染色標(biāo)本的表達(dá)中,不正確的選項(xiàng)是A.材料要穎并馬上處理或準(zhǔn)時(shí)冷藏B.切片標(biāo)本一般不宜固定C.假設(shè)為組織材料,一般不宜承受石蠟切片法D.脫落細(xì)胞可承受直接涂片法E.標(biāo)本切片要求盡量薄『正確答案』B『答案解析』制作熒光抗體染色標(biāo)本,切片標(biāo)本應(yīng)固定。以下關(guān)于直接法熒光抗體試驗(yàn)的表達(dá)中,不正確的選項(xiàng)是A.簡(jiǎn)便易行,特異性好B.敏感
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