細胞生物學（王金發(fā)版）第二章細胞生物學研究方法

第二章細胞生物學研究方法細胞生物學以細胞為研究對象，從細胞的整體水平、亞顯微水平、分子水平三個層次，以動態(tài)的觀點研究細胞和細胞器結構和功能、細胞生活史和各種生命活動。1．細胞結構、成分的觀察-顯微成像技術原理：照明系統(tǒng)發(fā)出的光線或電子束通過樣品時，與樣品發(fā)生相互作用，其被改變的物理特征被肉眼觀察或通過探測器檢測而成像。分辨率：r=0.61λ/nsinα；分辨極限：一定波長的射線不能用以探測比它本身波長短得多的結構細節(jié)。1.1普通光學顯微鏡及樣品制備1.1.1各種光學顯微鏡普通光學顯微鏡熒光顯微鏡：利用紫外線為光源照射樣品，使之發(fā)生熒光。相差顯微鏡：將不同成分的衍射系數(shù)改變?yōu)槊靼底兓?。暗視野顯微鏡：利用散射或衍射光增大反差。倒置顯微鏡：普通光學顯微鏡的倒置。1.1.2樣品制備取材、固定（殺死細胞，穩(wěn)定細胞的成分，形成一定硬度）、包埋、切片、染色、觀察。放射性自顯影：放射性同位素標記、底片。1.2電子顯微鏡及其樣品制備1.2.1電子顯微鏡透射電子顯微鏡照明系統(tǒng)為電子束，電磁透鏡調整電子束的亮度與聚焦，真空系統(tǒng)保護電子槍等。掃描電子顯微鏡極狹窄電子束掃描樣品，利用樣品表面形成的二次電子信號成像。掃描透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡與掃描電子顯微鏡的結合：電子束掃描，透射電子成像。1.2.2樣品制備步驟：取材、固定、包埋、切片（超薄切片）、染色（負染色等）、觀察（放在載網上）。負染色：利用重金屬鹽對樣品進行染色，電子密度高的重金屬鹽包埋了樣品中低電子密度的背景，增強了背景散射電子的能力以提高反差。噴鍍技術：以一定角度在樣品的表面鍍上一層金屬，增強背景和待觀察樣品反差的方法。冷凍斷裂復型和冷凍蝕刻：生物樣品在液氮中迅速冷凍，然后迅速放入冷凍裝置中，并迅速抽成真空，用冰刀切割，然后觀察切口表面；或將其溫度稍微升高，使樣品中的冰升華，會在表面浮雕出細胞膜的超微結構。1.3間接成像技術掃描隧道顯微鏡：利用量子力學的隧道效應，探針尖端與樣品表面可產生隧道電流，其值與距離呈指數(shù)變化關系。原子力顯微鏡：掃描隧道顯微鏡修改，利用探針原子與樣品表面的原子力的變化。X射線衍射技術：在原子分辨的水平上推測分子的結構。2．細胞成分的組成、分布-細胞化學技術2.1酶細胞化學技術初級反應：細胞內酶作用于底物產生初級反應產物。捕捉反應：初級反應產物與捕捉劑相互作用，產生顯微鏡下可見的最終反應產物。2.2免疫細胞化學技術利用免疫反應定位組織或細胞中的抗原成分分布。包括免疫熒光技術和免疫電鏡技術。2.3其它顯微分光光度術、顯微熒光光度術用來對相關成分進行定性、定量、分布的觀察。核磁共振技術分析有機化合物結構。3．細胞及成分的分離-細胞分選技術、分離技術3.1細胞分選技術流式細胞儀：流室，激光光源，訊號檢測器，訊號分析部件，無細胞液滴收集器。細胞分選過程：細胞液經流室形成單細胞懸液，激光檢測帶有熒光標記的細胞，信號檢測分析使液滴充電，經電場分選進入無細胞液滴收集器。3.2分離技術3.2.1離心分離技術（1）速度離心分離細胞器和大分子在一定的離心速度下，不同大小的細胞器由于體積的不同，沉降速度也就不同，體積大的沉降快。差速離心：采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。移動區(qū)帶離心：利用蔗糖或甘油制備輕微的連續(xù)密度，較長時間的離心。建立密度梯度的原因使防止擴散，但任一組分的密度都大于連續(xù)密度的最大值。（2）等速度離心分離細胞器和大分子利用介質產生一種密度梯度，覆蓋了待分離物質的密度，通過離心使不同密度的顆粒停留在相應的介質密度區(qū)。介質可以是蔗糖或甘油，其密度較小，適于分離細胞器等；或利用CsCl，能夠自發(fā)建立密度梯度，同時密度比較大，適合分離DNA,RNA等。3.2.2層析分離技術根據混合物中各組分在物理化學性質等方面的差異在固定相與流動相間進行反復多次的分配而得以使各組分的移動速度產生差異而分離。（1）凝膠過濾層析根據蛋白質的大小和形狀進行分離純化。（2）親和層析根據生物分子中有些分子的特定結合特性分離純化成分。（3）離子交換層析根據蛋白質在不同pH環(huán)境下具有不同的帶電特性，而與固定相的特定電荷相互作用而分離純化。4．細胞培養(yǎng)-細胞工程技術在體外模擬體內的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體取出的細胞。4.1培養(yǎng)條件注意三個環(huán)節(jié)：營養(yǎng)、生存環(huán)境、廢物的排除。4.2培養(yǎng)過程原代細胞培養(yǎng)產生細胞系，再經傳代培養(yǎng)得到具有特殊性質或標志的細胞株。4.3培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)。5．與其它學科結合的相關技術-單克隆抗體技術、顯微操作技術、分子生物學方法等5.1單克隆抗體技術B細胞與突變的骨髓腫瘤細胞發(fā)生細胞融合，產生既能產生單一抗體，又能不斷增殖的雜種細胞。5.2顯微操作術用于對細胞的解剖手術及微量注射的技術。5.3分子生物學方法5.3.1基因工程選擇目的基因構建工程質粒，導入載體中表達，產生產品或進行基因功能的分析。5.3.2P復制目的DNA片段。步驟：引物設計和合成、DNA模版的制備、PCR反應、產物的分離和純化。5.3.3選擇性基因Knockout和轉基因鼠目的基因插入正選擇標記基因，末端插入負選擇標記，導入胚胎干細胞，進行基因重組，然后篩選出正確重