細(xì)胞生物學(xué)（王金發(fā)版）第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)以細(xì)胞為研究對(duì)象，從細(xì)胞的整體水平、亞顯微水平、分子水平三個(gè)層次，以動(dòng)態(tài)的觀點(diǎn)研究細(xì)胞和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能、細(xì)胞生活史和各種生命活動(dòng)。1．細(xì)胞結(jié)構(gòu)、成分的觀察-顯微成像技術(shù)原理：照明系統(tǒng)發(fā)出的光線或電子束通過(guò)樣品時(shí)，與樣品發(fā)生相互作用，其被改變的物理特征被肉眼觀察或通過(guò)探測(cè)器檢測(cè)而成像。分辨率：r=0.61λ/nsinα；分辨極限：一定波長(zhǎng)的射線不能用以探測(cè)比它本身波長(zhǎng)短得多的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。1.1普通光學(xué)顯微鏡及樣品制備1.1.1各種光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡：利用紫外線為光源照射樣品，使之發(fā)生熒光。相差顯微鏡：將不同成分的衍射系數(shù)改變?yōu)槊靼底兓?。暗視野顯微鏡：利用散射或衍射光增大反差。倒置顯微鏡：普通光學(xué)顯微鏡的倒置。1.1.2樣品制備取材、固定（殺死細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞的成分，形成一定硬度）、包埋、切片、染色、觀察。放射性自顯影：放射性同位素標(biāo)記、底片。1.2電子顯微鏡及其樣品制備1.2.1電子顯微鏡透射電子顯微鏡照明系統(tǒng)為電子束，電磁透鏡調(diào)整電子束的亮度與聚焦，真空系統(tǒng)保護(hù)電子槍等。掃描電子顯微鏡極狹窄電子束掃描樣品，利用樣品表面形成的二次電子信號(hào)成像。掃描透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡與掃描電子顯微鏡的結(jié)合：電子束掃描，透射電子成像。1.2.2樣品制備步驟：取材、固定、包埋、切片（超薄切片）、染色（負(fù)染色等）、觀察（放在載網(wǎng)上）。負(fù)染色：利用重金屬鹽對(duì)樣品進(jìn)行染色，電子密度高的重金屬鹽包埋了樣品中低電子密度的背景，增強(qiáng)了背景散射電子的能力以提高反差。噴鍍技術(shù)：以一定角度在樣品的表面鍍上一層金屬，增強(qiáng)背景和待觀察樣品反差的方法。冷凍斷裂復(fù)型和冷凍蝕刻：生物樣品在液氮中迅速冷凍，然后迅速放入冷凍裝置中，并迅速抽成真空，用冰刀切割，然后觀察切口表面；或?qū)⑵錅囟壬晕⑸撸箻悠分械谋A，會(huì)在表面浮雕出細(xì)胞膜的超微結(jié)構(gòu)。1.3間接成像技術(shù)掃描隧道顯微鏡：利用量子力學(xué)的隧道效應(yīng)，探針尖端與樣品表面可產(chǎn)生隧道電流，其值與距離呈指數(shù)變化關(guān)系。原子力顯微鏡：掃描隧道顯微鏡修改，利用探針原子與樣品表面的原子力的變化。X射線衍射技術(shù)：在原子分辨的水平上推測(cè)分子的結(jié)構(gòu)。2．細(xì)胞成分的組成、分布-細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2.1酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)初級(jí)反應(yīng)：細(xì)胞內(nèi)酶作用于底物產(chǎn)生初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物。捕捉反應(yīng)：初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物與捕捉劑相互作用，產(chǎn)生顯微鏡下可見(jiàn)的最終反應(yīng)產(chǎn)物。2.2免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)利用免疫反應(yīng)定位組織或細(xì)胞中的抗原成分分布。包括免疫熒光技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。2.3其它顯微分光光度術(shù)、顯微熒光光度術(shù)用來(lái)對(duì)相關(guān)成分進(jìn)行定性、定量、分布的觀察。核磁共振技術(shù)分析有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)。3．細(xì)胞及成分的分離-細(xì)胞分選技術(shù)、分離技術(shù)3.1細(xì)胞分選技術(shù)流式細(xì)胞儀：流室，激光光源，訊號(hào)檢測(cè)器，訊號(hào)分析部件，無(wú)細(xì)胞液滴收集器。細(xì)胞分選過(guò)程：細(xì)胞液經(jīng)流室形成單細(xì)胞懸液，激光檢測(cè)帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞，信號(hào)檢測(cè)分析使液滴充電，經(jīng)電場(chǎng)分選進(jìn)入無(wú)細(xì)胞液滴收集器。3.2分離技術(shù)3.2.1離心分離技術(shù)（1）速度離心分離細(xì)胞器和大分子在一定的離心速度下，不同大小的細(xì)胞器由于體積的不同，沉降速度也就不同，體積大的沉降快。差速離心：采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。移動(dòng)區(qū)帶離心：利用蔗糖或甘油制備輕微的連續(xù)密度，較長(zhǎng)時(shí)間的離心。建立密度梯度的原因使防止擴(kuò)散，但任一組分的密度都大于連續(xù)密度的最大值。（2）等速度離心分離細(xì)胞器和大分子利用介質(zhì)產(chǎn)生一種密度梯度，覆蓋了待分離物質(zhì)的密度，通過(guò)離心使不同密度的顆粒停留在相應(yīng)的介質(zhì)密度區(qū)。介質(zhì)可以是蔗糖或甘油，其密度較小，適于分離細(xì)胞器等；或利用CsCl，能夠自發(fā)建立密度梯度，同時(shí)密度比較大，適合分離DNA,RNA等。3.2.2層析分離技術(shù)根據(jù)混合物中各組分在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異在固定相與流動(dòng)相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配而得以使各組分的移動(dòng)速度產(chǎn)生差異而分離。（1）凝膠過(guò)濾層析根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀進(jìn)行分離純化。（2）親和層析根據(jù)生物分子中有些分子的特定結(jié)合特性分離純化成分。（3）離子交換層析根據(jù)蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境下具有不同的帶電特性，而與固定相的特定電荷相互作用而分離純化。4．細(xì)胞培養(yǎng)-細(xì)胞工程技術(shù)在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機(jī)體取出的細(xì)胞。4.1培養(yǎng)條件注意三個(gè)環(huán)節(jié)：營(yíng)養(yǎng)、生存環(huán)境、廢物的排除。4.2培養(yǎng)過(guò)程原代細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生細(xì)胞系，再經(jīng)傳代培養(yǎng)得到具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞株。4.3培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)。5．與其它學(xué)科結(jié)合的相關(guān)技術(shù)-單克隆抗體技術(shù)、顯微操作技術(shù)、分子生物學(xué)方法等5.1單克隆抗體技術(shù)B細(xì)胞與突變的骨髓腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞融合，產(chǎn)生既能產(chǎn)生單一抗體，又能不斷增殖的雜種細(xì)胞。5.2顯微操作術(shù)用于對(duì)細(xì)胞的解剖手術(shù)及微量注射的技術(shù)。5.3分子生物學(xué)方法5.3.1基因工程選擇目的基因構(gòu)建工程質(zhì)粒，導(dǎo)入載體中表達(dá)，產(chǎn)生產(chǎn)品或進(jìn)行基因功能的分析。5.3.2P復(fù)制目的DNA片段。步驟：引物設(shè)計(jì)和合成、DNA模版的制備、PCR反應(yīng)、產(chǎn)物的分離和純化。5.3.3選擇性基因Knockout和轉(zhuǎn)基因鼠目的基因插入正選擇標(biāo)記基因，末端插入負(fù)選擇標(biāo)記，導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，進(jìn)行基因重組，然后篩選出正確重