用PCR擴(kuò)增cDNA庫(kù)中的特異序列

PCR技術(shù)(十七)：用PCR擴(kuò)增cDNA庫(kù)中的特異序列最常用的基因分離方法需要建立組織或細(xì)胞RNA的cDNA庫(kù)，然后用抗體或DNA探針篩選出感興趣的基因。雖然這個(gè)方法已成功地克隆了大量基因，但建立和篩選CDNA庫(kù)是一項(xiàng)非常耗時(shí).費(fèi)力的工作，而且用寡聚核苷酸作探針進(jìn)行篩選需大量蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)的資料。聚合酶鏈的反應(yīng)(PCR)方法可使一種特異DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍，并已成為分子克隆和診斷的十分有用的工具。最近，TAQDNA聚合酶的使用極大地簡(jiǎn)化了PCR方法。該酶在75°C左右有很寬的最適溫度區(qū)，在小于95C以下重復(fù)保溫仍能存活，更重要的是，該酶活性高，無(wú)外切酶活性，因此理論上不用通過(guò)建立和篩選基因庫(kù)的所用步驟就能從序列編碼的基因作模板以探索一種簡(jiǎn)單.快速的基因分離方法。下面我們將描述在鑒定南美蝙蝠唾液腺外分泌蛋白中使用的方法和過(guò)程。Dr.S.Gardell(MSDRL，WestPoint，PA)純化了從南美蝙蝠唾液腺中分離的一種外分泌蛋白，因此其部分肽序列(GlyLeuGlyCysAspLeuMet)是開始本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。為檢驗(yàn)不用傳統(tǒng)篩選方法即能克隆該蛋白基因的假說(shuō)，我們采取了如下策略：a).在Lambdagt22中建立一個(gè)在蝙蝠唾液腺中所有轉(zhuǎn)錄子的cDNA庫(kù)，并在邊側(cè)加上SP6、T6聚合酶啟動(dòng)子，這樣可以直接用兩種啟動(dòng)子序列之一作引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。b).合成四組引物，組合起來(lái)代表已知的部分蛋白序列的全部有效密碼子組合(1024種衍生列)。C).這些引物與適當(dāng)?shù)腡7或SP6聚合酶序列引物組合成對(duì)，以總cDNA庫(kù)作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得到PCR產(chǎn)物應(yīng)該代表編碼該蛋白的部分cDNA。對(duì)這些PCR產(chǎn)物直接測(cè)序應(yīng)能得到足的序列信息以合成同源引物，進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生的DNA片段結(jié)合起來(lái)可給出編碼該蛋白的cDNA的完整序列。直接用2%瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物，組混合引物［引物1:5'(CT)TXGG(ACGT)TG(CT)GA(CT)(CT)TXATG3'，。每組混合引物產(chǎn)生約450bp和550bp的兩個(gè)產(chǎn)物。用Wong等所述的方法進(jìn)行凝膠純化和測(cè)序該P(yáng)CR的主要產(chǎn)物450bp帶。混合引物產(chǎn)生清蜥可讀的序列(約200個(gè)核苷酸)，雖然可有256種引物組人合(簡(jiǎn)并度)。在這個(gè)序列信息的基礎(chǔ)上，合成另兩組引物［引物11(正向)］分別與SP6或T7聚合酶序列引物配對(duì)，按前面所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物II/SP6和引物III/T7分別產(chǎn)生270bp和420bp片段，測(cè)定這兩個(gè)片段序列，與最初得到的DNA片段結(jié)合來(lái)，得到一個(gè)467bp編碼序列。該cDNA(270BP+420bp)的多余序列為200bp的PolyA尾序。PCR策略(A)n、(C)n、(G)n、(T)N:同聚物序列SP6，T7:SP6和T7聚合酶啟動(dòng)子，分別構(gòu)建入Lambdagt載體。B.瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物。PCR在總體積100〃，l含50mMKCL、10mMTris，pH8.3，1.5mMMgCl2,0.01%明膠，200pM每種dNTP,2.5uTup聚合酶，150ng噬菌體庫(kù)模板DNA，50ng(0.1nmoles)每種引物的體系中進(jìn)行。程序如下:初始模板變性94°C,8分鐘;之后為94°C2分種，60°C3分種，30個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用氯仿抽提以除運(yùn)送放物油，從100^1中取5^1樣品加到2%瓊脂糖凝膠上。漠化乙啶染色。GGATGACCACCCACAGCAGCTGCCTAACCATGAAGCTGGTGACCATCCTCATGCTGACCGCCCTCCCCCTGTACTGETATGCGGGGCTTGGELGEGATCTTATGGACAATGTGGTCAARTTGACCATCGATTCTAATGTGGACGTGAATACATACATCGATAACCTGAAAGAGTTCCTACCAGGTGAAGAAACTCAAGAGGCCTTCAAATTCATGAAGGAATGCTTTETCGATCAGAGCGAAGAAACTCTGGAGAAGATCAAAGTTCTGCAGCAATCGATATACAGTAGCGTTTGGTGTGCTCGGGACACTAACTTCACATGACCACAGAGATTGTCCACAGACCAACTGTCCATTGGTAGAAGCCECAGCTGAGCTTTCCTTCTTCATCCTTCGATCTACAAATGCAAGACAATTGTAAACCTGACATACGTTTGEATTTCAATAAAGCATCCTGCAAAACCAAAAA核苷酸序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列。從制備性瓊脂糖凝膠中分離PCR產(chǎn)物，并按廠商說(shuō)明書(Bio101)用Geneclean純化。按廠商說(shuō)明書(美國(guó)Biochemical序列酶)，用32P5'末端標(biāo)記引物和修飾過(guò)的T7聚合酶(測(cè)序酶)測(cè)序。每個(gè)反應(yīng)含100ng(0.4pmoles)模板DNA和20ng(4pmoles)5'32P末端標(biāo)記的引物，每反應(yīng)為2卓106cpm。劃線部分為起始本實(shí)驗(yàn)的多序列。計(jì)算機(jī)分析表明該cDNA含有一個(gè)可讀框，編碼110個(gè)氨基酸，起始的18個(gè)氨基酸推測(cè)為信號(hào)肽，還發(fā)現(xiàn)用于起始這種蝙蝠唾液蛋白實(shí)驗(yàn)的七個(gè)氨基酸在蛋白的N-末端(圖2,劃線部分)。檢索NBRF數(shù)據(jù)庫(kù)揭示該蛋白與鼠前列腺類固醇結(jié)合蛋白C3鏈前體有39%的同源性，最重要的同源性是成熟蛋白中所有三個(gè)半胱氨酸殘基的位置。我們已經(jīng)證明聚合酶鏈反應(yīng)可以用于從復(fù)雜分子庫(kù)如cDNA庫(kù)擴(kuò)增特異的DNA序列。在本實(shí)驗(yàn)中專門設(shè)計(jì)的Lambdgt22載體，通過(guò)用含有適當(dāng)內(nèi)切酶位點(diǎn)和聚合酶啟動(dòng)子序列的5'端、3'端引物接頭定向克隆cDNA分子。從克隆的PCR產(chǎn)物制備序列特異的探針，用傳統(tǒng)方法篩選基因庫(kù)，我們估計(jì)分離cDNA的豐度為每10，000個(gè)噬菌體重組子中有1個(gè)克隆。用一組代表簡(jiǎn)并度為256的寡聚核苷酸引物能進(jìn)行特異擴(kuò)增的事實(shí)進(jìn)一步表明了該