線栓法大鼠腦缺血再灌注模型的制備

線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究馬賢德1孫宏偉1柴紀嚴1趙金茹1(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽110032；)摘要①目的建立一種比較系統(tǒng)，操作簡單，成功率高的大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)再灌注動物模型，達到只要讀者根據(jù)本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型的目的。②方法成年健康雄性SD大鼠40只，參照Longa法并適當(dāng)改進建立MCAO模型20只，假手術(shù)組20只。本文將詳細敘述手術(shù)過程以及再灌注時間點的合理選擇。最后利用行為學(xué)測試、四氮唑(TTC)染色對模型成功與否進行判定。③結(jié)論線栓法是一種操作簡單的制備MCAO再灌注動物模型的方法，并且此方法的再灌注效果較為明顯。關(guān)鍵詞動物模型；腦缺血；再灌注；線栓法Establishmentamodelofratischemia-reperfusioninjurywithintraluminalsutureMaXian-de1SunHong-wei1ChaiJi-yan1ZhaoJin-ru1(1.LiaoningUniversityofChineseTraditionalMedicine,Shenyang,110032)Abstract:ObjectiveToestablishamodelofratischemia-reperfusioninjury,intermsofthemodel,theoperationwillbesimple,andtheachievementratiowillbehigh.Methods:40MaleSprague-Dawley(SD)ratswereseparatedintotwogroupsrandomly:20weremodelofratischemia-reperfusioninjurybasedonLongamethod,andtheother20weresham-operatedgroup.Theprocessoftheoperationandtheselectionofdifferenttimepointfollowingischemic-reperfusionwerediscussedinthepaper.What’smore,themodelwasappraisedbybehavioraltestandTriphenylTetrazoliumCholoride(TTC)Staining.Conclusion:Theoperationofintraluminalsuturemethodisverysimplefortheestablishmentofmodelofratischemia-reperfusion,what’smore,theeffectofreperfusionisveryobvious.Keywords:AnimalModel,ischemia,reperfusion,intraluminalsuture腦缺血再灌注動物模型是研究缺血性腦血管病的一條重要途徑，因為腦缺血再灌注動物模型具有很好的重復(fù)性并能最大程度模擬人類缺血性卒中的發(fā)生。早在1986年，日本學(xué)者Koizumi發(fā)明了線栓法制備局灶性腦缺血大鼠模型。1995年，我國也出現(xiàn)了相關(guān)的報道。目前人們比較公認的是Longa等建立的大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)再灌注動物模型。國內(nèi)一些學(xué)者對此方法又進行了改進，但仍存在一些問題，例如：手術(shù)操作過程復(fù)雜，實驗動物死亡率較高，而模型成功率較低，并且在所發(fā)表的文章中普遍存在一個缺點，就是對該模型的制作過程描述得過于簡單，讀者往往不能按照此類文獻完成模型的制備工作。本文旨在前人研究的基礎(chǔ)上，建立一種操作簡單，成功率高的MCAO再灌注模型，并將此方法圖文并茂的展現(xiàn)給讀者，使讀者只要根據(jù)本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型。1材料與方法1.1實驗材料、動物及分組健康雄性SD大鼠40只，體重280-320g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為模型組和假手術(shù)組，每組20只。四氮唑紅(TTC)染料，由沈陽市博爾美試劑公司提供。1.2栓塞線的制備栓塞線采用2.5號釣魚線，直徑0.25-0.28mm。將其剪成4cm長，一端用細砂紙打磨成半球形(需在顯微鏡下篩選)，再用記號筆分別在距打磨端0.6cm處、1.8cm和2.2cm處作好標(biāo)記，以便在手術(shù)時隨時判斷栓塞線插入深度。1.3大鼠腦缺血模型的制作在室溫(22°C)條件下，大鼠用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上,頸部用碘伏消毒后正中偏右0.5cm處縱向切開2cm切口，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)(如圖一)。其中ECA需暴露出3-5mm,ICA需分離至翼腭動脈。在ECA遠端距CCA分叉處3-5mm處結(jié)扎ECA(如圖二)，注意：結(jié)扎用的手術(shù)線不要剪斷。再用電凝器在結(jié)扎點遠心端電凝ECA,用眼科手術(shù)剪在結(jié)扎點和電凝點之間剪斷ECA。然后將ECA向鼠尾方向牽拉，使ECA和ICA成一條直線。動脈夾夾閉CCA近心端和ICA遠心端，在ECA結(jié)扎點前端剪一“V”形小口(如圖三)，緩慢將栓塞線經(jīng)ECA插入ICA，打開ICA遠心端的動脈夾。根據(jù)栓塞線上的標(biāo)記，判斷栓塞線插入的深度。當(dāng)CCA分叉進入栓塞線1.8cm至2.2cm標(biāo)記之間區(qū)域時，插線力度一定要輕，稍感阻力立即停止向前插線。在“V”形切口近心端結(jié)扎ECA，使栓塞線和ECA固定在一起。剪斷各結(jié)扎點上的手術(shù)線，逐層縫合，將栓塞線多余的部分縫合在創(chuàng)口之間，暴露于皮外。1.4假手術(shù)模型的制備假手術(shù)組手術(shù)方式同模型組，但不做栓塞，僅暴露出右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，然后逐層縫合即可。1.5再灌注的時間及方法再灌注時間點的選擇十分重要，時間過短，神經(jīng)功能缺失體征不明顯；時間過長，腦組織缺血過于嚴重，失去治療意義。經(jīng)過多次試驗和文獻支撐，我們認為栓塞2小時后進行再灌注不僅神經(jīng)功能缺失體征明顯，TTC染色顯示腦組織壞死程度適中，而且如果能進行有效治療，可以得到滿意的治療效果。再灌注的具體方法是將縫合線打開，完全暴露栓塞線，用眼科鑷子固定結(jié)扎點，將栓塞線緩慢抽出，直至栓塞線上的0.6cm處標(biāo)記點暴露出來為止，剪掉栓塞線多余部分，逐層縫合創(chuàng)口。1.6神經(jīng)功能缺失體征評分參考Longa及Bederson的5分制法在動物麻醉清醒后24h進行評分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。分值越高，說明動物行為障礙越嚴重。1.7四氮唑紅染色大鼠缺血2h再灌注24h后立即斷頭取腦，以2%TTC常規(guī)染色,4%多聚甲醛固定保存。2結(jié)果2.1術(shù)中意外死亡率模型組20只大鼠中，意外死亡5只，其中術(shù)中死亡2只，術(shù)后24小時內(nèi)死亡3只，總死亡率25%；假手術(shù)組無死亡。死亡的5只大鼠中，經(jīng)腦組織TTC染色證實，有2只因右側(cè)大腦大面積梗死致死，另外3只大腦無缺血表現(xiàn)，分析原因可能因為麻醉程度過深致死。2.2神經(jīng)功能評分模型組為2.65+0.8127，假手術(shù)組3只評為1分，其余均為0分。圖為被評為3分和1分的模型組大鼠。被評為3分的模型大鼠 被評為1分的模型大鼠2.3腦組織TTC染色模型組剩余的15只大鼠腦組織經(jīng)2%TTC染色后發(fā)現(xiàn)，右側(cè)腦組織均有不同程度的缺血壞死灶，大小不一，位置在額、頂葉皮層居多，也有的在顳葉和新紋狀體外側(cè)部出現(xiàn)壞死。圖為模型組兩只大鼠的腦組織TTC染色照片。不同梗死程度大鼠的腦組織TTC染色3討論近年來，對大鼠腦缺血再灌注的動物模型研究很多，已建立多種制作方法，前人已摸索出的光化學(xué)誘導(dǎo)MCA血栓形成或經(jīng)顳下電凝MCA的方法［2］因創(chuàng)傷大，且不能夠進行再灌注等缺點，不適合于人類腦梗死后血管再通方面的研究。線栓法建立的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型不需開顱,創(chuàng)傷小，不影響缺血性腦病病理變化的自然過程，而且操作簡單,MCA閉塞效果好，可準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時間，是目前局灶性腦缺血及再灌注損傷研究較為理想的模型。模型制作過程中需要注意以下幾個問題：（1）大鼠的麻醉。麻醉程度要適中，過淺會影響手術(shù)過程的操作，過深會導(dǎo)致大鼠在術(shù)中的死亡。但大鼠自身也有一定的差異性，有些會對麻醉藥反映過于敏感，標(biāo)準(zhǔn)劑量也會致死，而有些對麻醉藥有一定的耐藥性，后一種情況較為好處理，可以在術(shù)前依據(jù)具體情況酌情追加一定量的麻醉藥。但特殊情況必定是少數(shù)的。（2）術(shù)中血管的分離。在分離右側(cè)CCA、ECA、ICA時，要特別注意迷走神經(jīng)的保護，一般用玻璃分針分離血管，可以減少對迷走神經(jīng)的損傷，盡量避免對迷走神經(jīng)的直接牽拉。（3）術(shù)中大鼠狀態(tài)的觀察。手術(shù)時，要密切觀察大鼠的狀態(tài)，如發(fā)現(xiàn)呼吸異常，可用鑷子將大鼠舌體牽向口角一側(cè)，防止舌根阻塞呼吸道窒息而死。（4）手術(shù)視野的處理。為了在手術(shù)時能有一個清晰的視野，可以自制一些金屬鉤，連接上橡皮筋，將切口向左右拉開，盡量擴大視野。（5）栓塞線的處理。栓塞線是模型成敗的關(guān)鍵，栓塞線一般選用釣魚線，可根據(jù)大鼠的體重來選擇型號，300g左右的大鼠可以選擇2.5號（直徑0.25-0.28mm）的釣魚線，以此為準(zhǔn)上下稍作浮動來選擇。釣魚線的打磨十分重要，由于用剪刀剪斷釣魚線時斷端過于銳利，如不做處理，在插線過程中很可能將動脈壁戳穿而導(dǎo)致失敗，因此要用細砂紙將斷端打磨圓滑，也有文獻報道用酒精燈將斷端燒成球形的，但燒成球形的頭部直徑無法控制，容易導(dǎo)致實驗的失敗。另外，在栓塞線上作標(biāo)記是明確栓塞深淺的最好辦法，不用模糊的判斷是否已經(jīng)栓塞到位，這也給模型的成功提供了保障。（6）栓塞線插入方向的調(diào)整。在插入栓塞線時，有時栓塞線只進入了1cm左右就遇到了阻力，這種情況多數(shù)都是由于栓塞線誤入了翼腭動脈而至。解決辦法有二，對于操作手法較好的實驗者來說，可以將ICA繼續(xù)向前分離，充分暴露出翼腭動脈，用眼科鑷子對栓塞線的方向作以糾正；而無法將ICA繼續(xù)進行分離的實驗者可以通過改變ECA斷端方向的方法來調(diào)整栓塞線的方向而使栓塞線順利進入ICA，這也是此種手術(shù)方式的優(yōu)勢所在。參考文獻：［1］ 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