第二章動物細(xì)胞工程演示文稿

第二章動物細(xì)胞工程演示文稿當(dāng)前第1頁\共有124頁\編于星期三\9點優(yōu)選第二章動物細(xì)胞工程當(dāng)前第2頁\共有124頁\編于星期三\9點

1.貼附型

大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，大致分成以下四型：

一、培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征當(dāng)前第3頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）成纖維細(xì)胞型

胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。當(dāng)前第4頁\共有124頁\編于星期三\9點名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的。來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮。形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)。生長特點：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個伸長的細(xì)胞突起。當(dāng)前第5頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）上皮型細(xì)胞細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。當(dāng)前第6頁\共有124頁\編于星期三\9點名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全相同。來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤。形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核。生長特點：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀

生長時呈膜狀移動，很少脫離細(xì)胞群而單個活動。當(dāng)前第7頁\共有124頁\編于星期三\9點（3）游走細(xì)胞型呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。（4）多型細(xì)胞型有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。Hepatocytes當(dāng)前第8頁\共有124頁\編于星期三\9點2.懸浮型見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。當(dāng)前第9頁\共有124頁\編于星期三\9點概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長。來源：血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞，癌腫細(xì)胞。特點：在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán)。優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，

易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)。缺點：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞)。當(dāng)前第10頁\共有124頁\編于星期三\9點1.培養(yǎng)細(xì)胞生命期（LifeSpanofCultureCells）所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程

當(dāng)前第11頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）原代培養(yǎng)期

也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。當(dāng)前第12頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）傳代期

原代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（DiploidCellLine）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前第13頁\共有124頁\編于星期三\9點（3）衰退期

此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（InfiniteCellLine），也稱連續(xù)細(xì)胞系（ContinuousCellLine）。當(dāng)前第14頁\共有124頁\編于星期三\9點2.組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期

所謂細(xì)胞“一代”，指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：當(dāng)前第15頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）潛伏期（LatentPhase）

細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。當(dāng)前第16頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）

這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)（MitoticIndex：MI）表示。當(dāng)前第17頁\共有124頁\編于星期三\9點

在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3-5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（DensityInhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。當(dāng)前第18頁\共有124頁\編于星期三\9點（3）停滯期（StagnatePhase）

細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。當(dāng)前第19頁\共有124頁\編于星期三\9點三、動物細(xì)胞體外培養(yǎng)動物組織器官切碎或酶解原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)當(dāng)前第20頁\共有124頁\編于星期三\9點1.原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)是從機體取得材料開始，在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)至第一次傳代前的這一過程。主要方法有組織塊培養(yǎng)、酶解培養(yǎng)法。2.傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。當(dāng)前第21頁\共有124頁\編于星期三\9點1.腫瘤細(xì)胞/細(xì)胞系的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。

四、特殊組織細(xì)胞的培養(yǎng)當(dāng)前第22頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性

腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。當(dāng)前第23頁\共有124頁\編于星期三\9點①形態(tài)和性狀

培養(yǎng)中腫瘤細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關(guān)。正常上皮極向消失排列紊亂層次增多當(dāng)前第24頁\共有124頁\編于星期三\9點14～6核∶漿=1∶4～611.1～1.2核∶漿=1∶1.1～1.2當(dāng)前第25頁\共有124頁\編于星期三\9點間期

前期

中期

后期

末期

正常細(xì)胞的有絲分裂過程

惡性腫瘤細(xì)胞的病理性核分裂像

當(dāng)前第26頁\共有124頁\編于星期三\9點②生長增殖

腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。腫瘤細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細(xì)胞培養(yǎng)時，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜?xì)胞強。腫瘤細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴展時，接觸抑制消除，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。

肺癌細(xì)胞當(dāng)前第27頁\共有124頁\編于星期三\9點③永生性

永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞是否如此尚無直接證明。乳腺癌細(xì)胞當(dāng)前第28頁\共有124頁\編于星期三\9點④浸潤性

浸潤性是腫瘤細(xì)胞擴張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。原發(fā)瘤血道轉(zhuǎn)移淋巴道轉(zhuǎn)移種植性轉(zhuǎn)移直接蔓延浸潤性生長當(dāng)前第29頁\共有124頁\編于星期三\9點⑤異質(zhì)性

所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織。正常腸粘膜結(jié)腸癌（與正常組織交界）當(dāng)前第30頁\共有124頁\編于星期三\9點⑥細(xì)胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。當(dāng)前第31頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）培養(yǎng)方法

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。當(dāng)前第32頁\共有124頁\編于星期三\9點

取材

人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。當(dāng)前第33頁\共有124頁\編于星期三\9點

培養(yǎng)基

腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。當(dāng)前第34頁\共有124頁\編于星期三\9點

成纖維細(xì)胞的排除

成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。當(dāng)前第35頁\共有124頁\編于星期三\9點抑制成纖維細(xì)胞生長因素方法因素組織細(xì)胞選擇性附著

選擇性附著底物

匯合飼養(yǎng)細(xì)胞層

選擇性培養(yǎng)基胰蛋白酶

膠原酶

聚丙烯酰胺

聚四氟乙烯（Teflon）

膠原（豬皮）

小鼠3T3

人胎小腸

D-纈氨酸（Valine）

MCDB-710

MCDB-153

Phenobarbitone胚胎小腸、心肌、表皮

乳癌

各種腫瘤

轉(zhuǎn)化細(xì)胞

表皮細(xì)胞

表皮

正常和惡性乳腺上皮

結(jié)腸癌

腎組織

乳腺

表皮

肝細(xì)胞當(dāng)前第36頁\共有124頁\編于星期三\9點

成纖維細(xì)胞排除法

機械刮除法：標(biāo)記→刮除→沖洗→培養(yǎng)

反復(fù)貼壁法：根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。

膠原酶消化法：本法是利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進(jìn)行選擇。當(dāng)前第37頁\共有124頁\編于星期三\9點【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。

【細(xì)胞生長增殖】檢測細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時間、細(xì)胞周期時間。

【細(xì)胞核型分析】檢測核型特點，染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無、帶型等。

【凝集試驗】檢測凝集力。

【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測集落形成能力。

【異體動物接種】向異體動物體內(nèi)（皮下）接種細(xì)胞懸液，觀察成瘤能力。

【其它】除上述項目外，根據(jù)需要還可做同位素標(biāo)記、組織化學(xué)成分分析，熒光顯微鏡觀察等。

體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測當(dāng)前第38頁\共有124頁\編于星期三\9點2.上皮細(xì)胞培養(yǎng)

上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。體內(nèi)上皮細(xì)胞生長在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞當(dāng)前第39頁\共有124頁\編于星期三\9點3.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元〕不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。當(dāng)前第40頁\共有124頁\編于星期三\9點4.巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系。肺巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌當(dāng)前第41頁\共有124頁\編于星期三\9點TheNIH/3T3,acontinuouscelllineofhighlycontact-inhibitedcellswasestablishedfromNIHSwissmouseembryoculturesinthesamemannerastheoriginalrandombred3T3andtheinbredBALB/c3T3.NIH／3T3五、一些重要的細(xì)胞系當(dāng)前第42頁\共有124頁\編于星期三\9點ThislinewasderivedfromtheCV-1cellline(ATCCCCL-70)bytransformationwithanorigindefectivemutantofSV40whichcodesforwild-typeTantigen.COS-7當(dāng)前第43頁\共有124頁\編于星期三\9點TheVerocelllinewasinitiatedfromthekidneyofanormaladultAfricangreenmonkeyonMarch27,1962,byY.YasumuraandY.KawakitaattheChibaUniversityinChiba,Japan.

Verocell當(dāng)前第44頁\共有124頁\編于星期三\9點EL4wasestablishedfromalymphomainducedinaC57BLmouseby9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene.

EL4淋巴瘤細(xì)胞當(dāng)前第45頁\共有124頁\編于星期三\9點HL-60isapromyelocyticcelllinederivedbyS.J.Collins,etal.Peripheralbloodleukocyteswereobtainedbyleukopheresisfroma36-year-oldCaucasianfemalewithacutepromyelocyticleukemia.

HL-60當(dāng)前第46頁\共有124頁\編于星期三\9點Thecellsexpress3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductaseandhepatictriglyceridelipaseactivities.HepG2當(dāng)前第47頁\共有124頁\編于星期三\9點NATUREREVIEWS|CANCERVOLUME2|APRIL2002|315－319當(dāng)前第48頁\共有124頁\編于星期三\9點腫瘤細(xì)胞:小鼠類EL4淋巴瘤Pcc4胚癌細(xì)胞EL4IL-2淋巴瘤P815肥大細(xì)胞瘤YAC-1淋巴瘤MFC前胃癌L1210淋巴白血病AtT20垂體瘤P388D1淋巴樣瘤NS-1骨髓瘤SRS-82腹水瘤SP2/0骨髓瘤SAC-IIB2腹水瘤P3-NS-1/1-Ag4.1骨髓瘤SAC-IIC3腹水瘤45.6.TG1.7骨髓瘤S180腹水瘤P3-X63-Ag8骨髓瘤B16黑色素瘤J774A.1單核細(xì)胞－巨噬細(xì)胞C127乳腺腫瘤RAW264.7單核細(xì)胞－巨噬細(xì)胞F9胚胎瘤NG108-15小鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤×大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞雜交細(xì)胞當(dāng)前第49頁\共有124頁\編于星期三\9點C6膠質(zhì)瘤RH－35肝癌SHZ－88乳腺癌CBRH－7919肝癌PC-12腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤

腫瘤細(xì)胞:大鼠類當(dāng)前第50頁\共有124頁\編于星期三\9點HBL-100乳腺細(xì)胞BT-325神經(jīng)膠質(zhì)瘤SMC-1惡性胸膜間皮瘤SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤A549肺癌U251星形膠質(zhì)瘤A2肺癌SHG-44膠質(zhì)瘤95-D高轉(zhuǎn)移肺癌A375惡性黑色素瘤Calu-3肺腺癌（胸膜滲出液）BowesMelanoma黑色素瘤LTEP-a-2肺腺癌MM96L黑色素瘤NCI-H460大細(xì)胞肺癌6T-CEMT細(xì)胞白血病SH-77小細(xì)胞肺癌J-111單核細(xì)胞白血病NCI-H446小細(xì)胞肺癌Dami巨核細(xì)胞SPC-A-1肺腺癌CHMas肥大細(xì)胞白血病SGC-7901胃腺癌HEL紅細(xì)胞白血病(Erythroleukemia)BGC-823低分化胃腺癌HL-60原髓細(xì)胞白血?。≒romyelocyticlenukemia）腫瘤細(xì)胞:人類當(dāng)前第51頁\共有124頁\編于星期三\9點MKN-45低分化胃癌K562慢性髓原白血病LoVo結(jié)腸腺癌Hut-78皮膚T細(xì)胞淋巴瘤Ls-174-T結(jié)腸腺癌Hut-102皮膚T細(xì)胞淋巴瘤HCT-8回盲腸腺癌NamalwaBurkitt`s淋巴瘤HCe-8693盲腸未分化腺癌Jurknt.CloneE6-1白血病細(xì)胞HR-8348直腸腺癌THP-1單核細(xì)胞BEL-7402肝癌U937組織細(xì)胞淋巴瘤BEL-7404肝癌Raji

Burkitt's淋巴瘤BEL-7405肝癌MEG-01成巨核細(xì)胞白血病HepG2肝細(xì)胞癌

腫瘤細(xì)胞:人類當(dāng)前第52頁\共有124頁\編于星期三\9點

大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞工程中重要的組成部分，是在人工條件下高密度大規(guī)模培養(yǎng)的用動、植物細(xì)胞來生產(chǎn)生物產(chǎn)品的技術(shù)。如今這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物制藥的研究和生產(chǎn)中，為生產(chǎn)疫苗、細(xì)胞因子、生物產(chǎn)品乃至人造組織等產(chǎn)品提供了強有力的工具。六、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)當(dāng)前第53頁\共有124頁\編于星期三\9點大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)前第54頁\共有124頁\編于星期三\9點旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（TheRotaryCellCultureSystem，RCCS）(1)高分化度:(2)模擬微重力:(3)三維細(xì)胞培養(yǎng):當(dāng)前第55頁\共有124頁\編于星期三\9點第二節(jié)細(xì)胞融合與單克隆抗體當(dāng)前第56頁\共有124頁\編于星期三\9點一、動物細(xì)胞融合1.概念兩個或兩個以上的細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的現(xiàn)象稱為細(xì)胞融合，也稱細(xì)胞雜交。細(xì)胞融合技術(shù)在基因定位、基因表達(dá)產(chǎn)物、腫瘤診斷核治療、生物新品種培育及單克隆抗體技術(shù)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景。當(dāng)前第57頁\共有124頁\編于星期三\9點紫外線喪失感染活性保留融合活性生物法：仙臺病毒化學(xué)法：PEG誘導(dǎo)物理法：電融合2.融合方法當(dāng)前第58頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）生物法：仙臺病毒當(dāng)前第59頁\共有124頁\編于星期三\9點生物法融合當(dāng)前第60頁\共有124頁\編于星期三\9點采用助融劑聚乙二醇（PEG）和高Ca2+、高pH相結(jié)合。PEG用于細(xì)胞融合至少有兩方面的作用：可促使細(xì)胞凝結(jié)；破壞互相接觸處的細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，從而使相互接觸的細(xì)胞膜之間發(fā)生融合，進(jìn)而細(xì)胞質(zhì)溝通，形成一個打的雙核或多核融合細(xì)胞。（2）化學(xué)法：PEG誘導(dǎo)當(dāng)前第61頁\共有124頁\編于星期三\9點（3）物理法：電融合

游離的動物細(xì)胞或原生質(zhì)體，置于電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細(xì)胞被極化，成為偶極子，造成細(xì)胞之間相互連接，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細(xì)胞接觸點部位的質(zhì)膜，此時質(zhì)膜脂類分子發(fā)生重組，同時由于細(xì)胞表面的張力作用，使兩細(xì)胞融合逐步完成。當(dāng)前第62頁\共有124頁\編于星期三\9點電融合當(dāng)前第63頁\共有124頁\編于星期三\9點3.融合細(xì)胞的篩選人工誘導(dǎo)形成的融合細(xì)胞有兩類，一類是同核體，另一類是異核體。把異核體從同核體以及未發(fā)生融合的親本細(xì)胞中分離出來。分離方法包括非選擇性篩選和選擇性篩選。當(dāng)前第64頁\共有124頁\編于星期三\9點（1）非選擇性篩選

非選擇性篩選是指用機械方法把單個融合細(xì)胞挑選出來，讓其分裂增殖，培養(yǎng)出細(xì)胞克隆，也稱單細(xì)胞克隆。其缺點是融合細(xì)胞數(shù)量很少，挑選不易，而且挑選出來的細(xì)胞不一定分裂，因此有時需要挑選并分離大量的融合細(xì)胞，才能獲得幾株細(xì)胞克隆。當(dāng)前第65頁\共有124頁\編于星期三\9點（2）選擇性篩選

是根據(jù)細(xì)胞對藥物的抗性、營養(yǎng)要求或溫度敏感性等的不同，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，將雜交細(xì)胞分離出來。①抗藥性篩選系統(tǒng)常用的培養(yǎng)基有HAT培養(yǎng)基。②營養(yǎng)缺陷型篩選系統(tǒng)當(dāng)前第66頁\共有124頁\編于星期三\9點二、單克隆抗體技術(shù)

通過融合兩種細(xì)胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長，小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即所謂“永生”性。在HAT選擇培養(yǎng)基的作用下，只有Ｂ細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆。當(dāng)前第67頁\共有124頁\編于星期三\9點單克隆抗體

由一個識別單一抗原決定簇（表位）的B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。單克隆抗體的特性：（1）理化性狀高度均一。（2）抗原結(jié)合性高度特異。（3）生物活性高度單一。當(dāng)前第68頁\共有124頁\編于星期三\9點表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體當(dāng)前第69頁\共有124頁\編于星期三\9點雜交瘤技術(shù)

通過融合經(jīng)免疫的小鼠脾細(xì)胞和建系小鼠骨髓瘤細(xì)胞，以獲得同時具有抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性特征的雜交瘤細(xì)胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。當(dāng)前第70頁\共有124頁\編于星期三\9點TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"GeorgesJ.F.Koehler

FederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunology

Basel,Switzerlandb.1946d.1995

CarMilstein

ArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiology

Cambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)

d.2002當(dāng)前第71頁\共有124頁\編于星期三\9點當(dāng)前第72頁\共有124頁\編于星期三\9點單克隆抗體制備過程（1）致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備（2）骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備（3）細(xì)胞融合（4）選擇性培養(yǎng)（5）抗體分泌細(xì)胞的篩選（6）克隆化過程（7）單克隆抗體的制取當(dāng)前第73頁\共有124頁\編于星期三\9點抗原致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合選擇性培養(yǎng)抗體分泌細(xì)胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定當(dāng)前第74頁\共有124頁\編于星期三\9點致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備動物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài)抗原接種：方式——體內(nèi)、體外劑量——0.5-100g

次數(shù)——視抗原而定間隔——視抗原而定佐劑——視抗原而定收集時間：末次接種后72h當(dāng)前第75頁\共有124頁\編于星期三\9點骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞株處于良好的生長狀態(tài)細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)當(dāng)前第76頁\共有124頁\編于星期三\9點致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞離心1000rpm10min50%PEG1ml培養(yǎng)液

10ml離心1000rpm7min37。C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min加入HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞融合當(dāng)前第77頁\共有124頁\編于星期三\9點隨機融合后的細(xì)胞類型細(xì)胞組合HGPRT生長狀態(tài)淋巴細(xì)胞+骨髓瘤+長期生長淋巴細(xì)胞+淋巴細(xì)胞+短期生長骨髓瘤+骨髓瘤-

不能生長未融合淋巴細(xì)胞+短期生長未融合骨髓瘤-不能生長當(dāng)前第78頁\共有124頁\編于星期三\9點HAT選擇培養(yǎng)原理核苷酸從頭合成途徑（denovosynthesis）核苷酸補救合成途徑（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）當(dāng)前第79頁\共有124頁\編于星期三\9點抗體分泌細(xì)胞的篩選對篩選方法的要求：

多——大量樣品一次檢測

快——迅速取得檢測結(jié)果

準(zhǔn)——檢測結(jié)果可靠性高

靈——檢測方法靈敏度高常用篩選方法：

ELISA、RIA、CDC、IFA等當(dāng)前第80頁\共有124頁\編于星期三\9點克隆化過程概念：建立單一細(xì)胞克隆方法：有限稀釋法克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽性孔飼養(yǎng)細(xì)胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細(xì)胞當(dāng)前第81頁\共有124頁\編于星期三\9點有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔當(dāng)前第82頁\共有124頁\編于星期三\9點單克隆抗體的制取制取方式：體外——培養(yǎng)罐法體內(nèi)——腹腔接種純化：鹽析、層析、制備型HPLC鑒定：特征鑒定——Ig類型、親和力、效價、特異性決定簇鑒定——是否針對同一決定簇當(dāng)前第83頁\共有124頁\編于星期三\9點單克隆抗體制備當(dāng)前第84頁\共有124頁\編于星期三\9點第三節(jié)細(xì)胞核移植與克隆技術(shù)當(dāng)前第85頁\共有124頁\編于星期三\9點一、歷史回顧1932年Spemann提出設(shè)想：分化了的細(xì)胞核移入卵子中能否指導(dǎo)胚胎發(fā)育？1952年Briggs和King在兩棲動物證實了Spemann提出設(shè)想1955年他們獲得了一只蝌蚪的細(xì)胞創(chuàng)造了與原版完全一樣的復(fù)制品。當(dāng)前第86頁\共有124頁\編于星期三\9點二、細(xì)胞核移植

將早期胚胎、胎兒或成體動物的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，重新組成重構(gòu)胚并使之發(fā)育成成體動物的過程。當(dāng)前第87頁\共有124頁\編于星期三\9點去核的方法（1）直接穿刺法。（2）盲吸法。（3）半卵法。（4）用DNA熒光染料對卵母細(xì)胞染色，然后在熒光監(jiān)視下去核。（5）功能性去核，將卵母細(xì)胞置于用熒光燃料配置的溶液中,用紫外線照射使核失去功能。

當(dāng)前第88頁\共有124頁\編于星期三\9點A

顯微注射針刺入卵母細(xì)胞前B開始吸取第一極體C

極體已被吸入注射針D

去除極體后的卵母細(xì)胞E

注射供體細(xì)胞F

供體細(xì)胞已被注入透明帶下核移植的顯微操作過程AFEDCB當(dāng)前第89頁\共有124頁\編于星期三\9點電融合當(dāng)前第90頁\共有124頁\編于星期三\9點重構(gòu)卵激活

核移植過程中的激活就是模仿受精過程中精子的刺激作用。激活的方式有電激活、化學(xué)激活和注射精子因子激活。

當(dāng)前第91頁\共有124頁\編于星期三\9點重構(gòu)胚的培養(yǎng)

重構(gòu)胚移入受體之前的培養(yǎng)方法有體外培養(yǎng)和體內(nèi)培養(yǎng)兩種方法。體外培養(yǎng)法相對要簡單方便的多。當(dāng)前第92頁\共有124頁\編于星期三\9點重構(gòu)胚的遺傳學(xué)鑒定利用種屬特異性探針（人類X、Y探針）對卵裂球細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交。當(dāng)前第93頁\共有124頁\編于星期三\9點供體細(xì)胞培養(yǎng)（MⅡ卵母細(xì)胞）減數(shù)第二次分裂中期去核的卵母細(xì)胞供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞受體細(xì)胞激活，完成減數(shù)分裂、發(fā)育胚胎移植當(dāng)前第94頁\共有124頁\編于星期三\9點三、核移植分類根據(jù)核供體細(xì)胞來源的不同：（1）胚胎細(xì)胞的核移植（2）體細(xì)胞的核移植根據(jù)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞是否來源于同一種動物：（1）同種核移植（2）異種核移植當(dāng)前第95頁\共有124頁\編于星期三\9點胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)胚胎細(xì)胞核移植(embryocelluncleartransplantation)：將一個早期胚胎的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，構(gòu)建新合子的生物技術(shù)，通常將提供細(xì)胞核的細(xì)胞稱為供體，接受細(xì)胞核的卵母細(xì)胞稱為受體。核移植所用的供體細(xì)胞均為囊胚階段以前的胚胎細(xì)胞。當(dāng)時人們普遍認(rèn)為，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后則隨著分化而逐漸喪失其全能性。當(dāng)前第96頁\共有124頁\編于星期三\9點胚胎細(xì)胞核移植1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的伊爾門澤、美國杰克遜實驗室，首次對小鼠卵進(jìn)行核移植獲得成功。此后，胚胎細(xì)胞的核移植在多種動物上獲得了克隆后代，如綿羊(Willadsen等,1986),牛(Prather等,1987),兔(Stice等,1988),豬(Prather等,1989),山羊(張勇等,1991)等。直到1997年才由

Mengetal成功地克隆出兩只猴,這是靈長類動物的首次被克隆。

當(dāng)前第97頁\共有124頁\編于星期三\9點胚胎細(xì)胞核移植存在的問題對于瀕危動物來說，由于種群數(shù)量有限，卵母細(xì)胞較難獲得；而在人類，由于倫理等原因，卵母細(xì)胞的獲得同樣困難。核供體、核受體胚胎來源困難。限制了核移植技術(shù)為人類服務(wù)的初衷。當(dāng)前第98頁\共有124頁\編于星期三\9點解決辦法（1）體細(xì)胞核移植——

解決供核困難（2）異種胚胎核移植——解決核受體胚胎來源困難當(dāng)前第99頁\共有124頁\編于星期三\9點問題當(dāng)時人們普遍認(rèn)為，早期胚胎尚具有全能性，到囊胚以后則隨著分化而逐漸喪失其全能性。哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞發(fā)生了分化，但是在適宜環(huán)境下，已分化的細(xì)胞能否重新恢復(fù)到發(fā)育的起始狀態(tài)，再重新發(fā)育成其它類型細(xì)胞組織的多能性，甚至發(fā)育成完整個體的全能性呢？?當(dāng)前第100頁\共有124頁\編于星期三\9點核重編程

核重編程的過程就是使在體細(xì)胞中被關(guān)閉，而在正常胚胎發(fā)育中表達(dá)的基因重新被激活的過程。重編程有三種可能的結(jié)果：（1）供核基因組完全沒有進(jìn)行重編程，重構(gòu)胚很快死亡；（2）部分重編程，重構(gòu)胚在不同的發(fā)育階段死亡；（3）完全重編程，產(chǎn)生正常的克隆動物。當(dāng)前第101頁\共有124頁\編于星期三\9點Modelofsequentialstepsinthereprogrammingofsomaticcells當(dāng)前第102頁\共有124頁\編于星期三\9點當(dāng)前第103頁\共有124頁\編于星期三\9點當(dāng)前第104頁\共有124頁\編于星期三\9點當(dāng)前第105頁\共有124頁\編于星期三\9點體細(xì)胞核移植技術(shù)(somaticcelluncleartransplantation)將分化程度較高的體細(xì)胞移植入去核的卵母細(xì)胞中構(gòu)建新合子的生物技術(shù)。

1996年，世界第一例從成年動物細(xì)胞克隆出的哺乳動物綿羊多莉誕生。這個秘密直到1997年2月才向世人公布。體細(xì)胞核移植技術(shù)——

動物克隆技術(shù)的里程碑當(dāng)前第106頁\共有124頁\編于星期三\9點克隆羊“多莉”首先使用藥物促使母羊排卵，接著把未受精的卵取出，利用顯微設(shè)備從卵中吸出所有的染色體，這樣就制成了一個有活性但沒有遺傳物質(zhì)的卵空殼。下一步是再從母羊乳腺中取出一個普通組織細(xì)胞，顯微注射卵空殼融合，通過電流刺激或化學(xué)激活，形成新的胚胎，再移植到受體羊的子宮，發(fā)育成含有新的遺傳物質(zhì)的新個體。當(dāng)前第107頁\共有124頁\編于星期三\9點黑面綿羊去核卵細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核重組細(xì)胞電脈沖刺激細(xì)胞培養(yǎng)早期胚胎另一頭母綿羊子宮克隆羊“多莉”妊娠當(dāng)前第108頁\共有124頁\編于星期三\9點當(dāng)前第109頁\共有124頁\編于星期三\9點1998年7月，美國夏威夷大學(xué)Wakayama等報道，由小鼠卵丘細(xì)胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，這是繼“多莉”以后的第二批哺乳動物體細(xì)胞核移植后代。此后，體細(xì)胞核移植技術(shù)在牛、山羊、豬等多種動物獲得成功。。至1999年底，全世界已有6種類型細(xì)胞——胎兒成纖維細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、輸卵管／子宮上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和耳部皮膚細(xì)胞的體細(xì)胞克隆后代成功誕生。

體細(xì)胞核移植

當(dāng)前第110頁\共有124頁\編于星期三\9點異種核移植

一種動物、人的體細(xì)胞作為核供體，另一種動物的卵母細(xì)胞為受體細(xì)胞而進(jìn)行的核移植技術(shù)。2004年01月24日

07:29中國首例異體克隆動物———瀕危動物北山羊當(dāng)前第111頁\共有124頁\編于星期三\9點人-兔異種體細(xì)胞核移植構(gòu)建重構(gòu)胚

MⅡ期兔卵母細(xì)胞人顆粒細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞顯微操作去除核及極體體外培養(yǎng)傳代、冷凍保存將單個體細(xì)胞注射入卵周隙

電融合激活體外培養(yǎng)

遺傳物質(zhì)鑒定當(dāng)前第112頁\共有124頁\編于星期三\9點克隆來源于英語“clone”或“cloning”的音譯，起源于希臘文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插條”繁殖。曾譯為無性生殖或無性繁殖，即由同一個祖先細(xì)胞分裂而形成的純細(xì)胞系，這個細(xì)胞系每個細(xì)胞的基因彼此是相同的。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過核移植與基因工程等技術(shù)也可獲得無性系，于是人們把實現(xiàn)無性繁殖的操作稱之為克隆。四、克隆技術(shù)當(dāng)前第113頁\共有124頁\編于星期三\9點動物克隆