固定化酶技術(shù)

固定化酶技術(shù)2021/5/911原理2特點(diǎn)3制備方法4應(yīng)用5發(fā)展趨勢(shì)及建議2021/5/92水溶性酶1原理

水不溶性載體固定化技術(shù)水不溶性酶（固定化酶）

2021/5/932特點(diǎn)穩(wěn)定性高；酶可反復(fù)使用；產(chǎn)物純度高，極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)；固定化酶的反應(yīng)條件易于控制生產(chǎn)可連續(xù)化和自動(dòng)化，節(jié)約勞動(dòng)力；設(shè)備小型化、可節(jié)約能源。

固定化酶同自由酶相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：2021/5/94缺點(diǎn)：固定化所需載體和試劑較貴，成本高，投資大固定化時(shí)，酶活力有損失長(zhǎng)期生產(chǎn)，易污染，載體易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)2021/5/953制備方法必須注意維持酶的催化活性及專(zhuān)一性。酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化）避免那些可能導(dǎo)致酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞的條件。由于酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)是憑借氫鍵、疏水鍵和離子鍵等弱鍵維持，所以固定化時(shí)要采取盡量溫和的條件，盡可能保護(hù)好酶蛋白的活性基團(tuán)?；驹瓌t：2021/5/96固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化。載體能抗一定的機(jī)械力。固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。酶與載體必須結(jié)合牢固，利于固定化酶的回收及反復(fù)使用。固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。2021/5/973.1固定化酶的傳統(tǒng)制備方法3.1.1吸附法吸附法是利用物理吸附法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類(lèi)或多孔玻璃、離子交換樹(shù)脂等載體上的固定方式。顯著特點(diǎn)是：工藝簡(jiǎn)便及條件溫和，包括無(wú)機(jī)、有機(jī)高分子材料，吸附過(guò)程可同時(shí)達(dá)到純化和固定化；酶失活后可重新活化，載體也可再生。但要求載體的比表面積要求較大，有活潑的表面。3.1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空載體中，而底物仍能滲入格子或微囊內(nèi)與酶相接觸。這個(gè)方法比較簡(jiǎn)便，酶分子僅僅是被包埋起來(lái)，生物活性被破壞的程度低，但此法對(duì)大分子底物不適用。2021/5/98(1)網(wǎng)格型將酶包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱(chēng)為網(wǎng)格型包埋法。也稱(chēng)為凝膠包埋法。(2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱(chēng)為微囊化法。2021/5/991.3結(jié)合法酶蛋白分子上與不溶性固相支持物表面上通過(guò)離子鍵結(jié)合而使酶固定的方法，叫離子鍵結(jié)合法。其間形成化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法叫共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法結(jié)合力牢固，使用過(guò)程中不易發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性能好。該法的缺點(diǎn)是載體的活化或固定化操作比較復(fù)雜，反應(yīng)條件也比較強(qiáng)烈，所以往往需要嚴(yán)格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶。2021/5/9101.4交聯(lián)法交聯(lián)法是用多功能試劑進(jìn)行酶蛋白之間的交聯(lián)，使酶分子和多功能試劑之間形成共價(jià)鍵，得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在著一定的分子內(nèi)交聯(lián)。多功能試劑制備固定化酶方法可分為：(1)單獨(dú)與酶作用；(2)酶吸附在載體表面上再經(jīng)受交聯(lián)；(3)多功能團(tuán)試劑與載體反應(yīng)得到有功能團(tuán)的載體，再連接酶。交聯(lián)劑的種類(lèi)很多，最常用的是戊二醛，其他的還有異氰酸衍生物、雙偶氮二聯(lián)苯胺、N，N-乙烯馬來(lái)酰亞胺等。交聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)是酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性較高；缺點(diǎn)是有的方法固定化操作較復(fù)雜，進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)易造成酶失活。2021/5/9113.2固定化酶的新型制備方法3.2.1共價(jià)固定法酶分子表面存在很多可供利用的化學(xué)基團(tuán)。選擇性地利用酶分子表面遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的特定稀有基團(tuán)(如巰基)進(jìn)行反應(yīng)，使該基團(tuán)與載體上另一基團(tuán)共價(jià)交聯(lián)來(lái)同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以達(dá)到控制其空間取向的目的。3.2.2氨基酸置換法利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在蛋白質(zhì)分子表面合適位置置換一個(gè)氨基酸分子，通過(guò)該氨基酸殘基特殊的側(cè)鏈基團(tuán)控制固定方向。通過(guò)定點(diǎn)突變?cè)诳莶莸鞍酌?subtil2isin)分子表面遠(yuǎn)離活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)殘基。經(jīng)蛋白質(zhì)空間折疊后暴露出Cys，然后利用Cys殘基上的巰基固定枯草蛋白酶分子，取得了較好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高。2021/5/9123.2.3抗體耦聯(lián)法大多數(shù)抗體具有足夠的穩(wěn)定性承受各種活化與偶聯(lián)方法?？贵w分子中很多可供偶聯(lián)用的官能團(tuán)可以通過(guò)賴(lài)氨酸的ε-氨基或末端氨基、天冬氨酸的β-氨基、谷氨酸的γ-氨基或末端羧基進(jìn)行一般性的偶聯(lián)。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠來(lái)定向固定抗體酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗體酶Fab片段保持了很好的催化活性?？贵w分子Fc區(qū)的糖鏈部分氧化可產(chǎn)生醛基，醛基與載體上的氨基通過(guò)縮合反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)定向固定。醛基若與載體上的酰肼通過(guò)腙鍵結(jié)合實(shí)現(xiàn)抗體分子的定向固定，與隨機(jī)固定相比，固定后抗體穩(wěn)定性提高的同時(shí)免疫吸附活性也提高了3倍。3.2.4生物素--親和素親合法生物素是存在于所有活細(xì)胞內(nèi)但含量甚微(<0．0001％)的中性小分子輔酶。親和素是一個(gè)含有四個(gè)相同亞基的四聚體，每個(gè)亞基均含一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)(解離常數(shù)10~5mol／L)。生物素與親和素或相應(yīng)細(xì)菌中的鏈霉親和素有高專(zhuān)一性的、極強(qiáng)的親和力。這種特性使其成為免疫分析、受體研究、免疫組織化學(xué)、基因工程和蛋白質(zhì)分離等領(lǐng)域中獨(dú)特有力的工具。Min等將生物素羧化載體蛋白、片段分別融合在熒光素酶和氧化還原酶的N末端，然后將這兩個(gè)融合蛋白定向固定在親和素包被的瓊脂顆粒上。熒光活性提高了8倍，固定化酶的穩(wěn)定性和固定效率均大大提高。2021/5/9134應(yīng)用4.1在食品中的應(yīng)用4.2在環(huán)境工程中的應(yīng)用4.3醫(yī)學(xué)和臨床分析的應(yīng)用2021/5/9144.1在食品中的應(yīng)用4.1.1固定化木瓜蛋白酶應(yīng)用于啤酒澄清長(zhǎng)期放置的啤酒會(huì)由于多肽和多酚物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)而變得混濁。為防止出現(xiàn)混濁，目前主要是采取向啤酒中添加蛋白酶來(lái)水解啤酒中的蛋白質(zhì)和多肽，但水解過(guò)度會(huì)影響啤酒保持泡沫的性能。Witt等1970年用戊二醛交聯(lián)將木瓜蛋白酶固定化制成反應(yīng)柱，生產(chǎn)所得啤酒在長(zhǎng)期貯存中可保持穩(wěn)定。Finely等人報(bào)道，用幾丁質(zhì)固定的木瓜蛋白酶可用于啤酒的大罐冷藏或過(guò)濾后裝瓶進(jìn)行處理，通過(guò)調(diào)節(jié)流速(酶柱法)和反應(yīng)時(shí)間(分批法)，可以精確控制蛋白質(zhì)的分解程度。處理后的啤酒和固定化酶易分開(kāi)，固定化酶可以多次反復(fù)使用，極為經(jīng)濟(jì)。經(jīng)處理后的啤酒在風(fēng)味上與傳統(tǒng)的啤酒無(wú)明顯差異。2021/5/9154.1.2固定化酶用于水解牛奶中的乳糖牛奶中含有4.3～4.5％的乳糖，患乳糖缺乏癥的人飲用牛奶后將導(dǎo)致不良后果，用乳糖酶可以將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反應(yīng)器可以連續(xù)處理牛奶，將乳糖分解。此外，固定化乳糖酶還可以用來(lái)分解乳糖，制造具有葡萄糖和半乳糖甜味的糖漿。乳糖在溫度較低時(shí)易結(jié)晶，用固定化乳糖酶處理后，可以防止其在冰激淋類(lèi)產(chǎn)品中結(jié)晶，改善口感，增加甜度。2021/5/9164.1.3固定化葡萄糖異構(gòu)酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應(yīng)用固定化葡萄糖異構(gòu)酶是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種，它可以來(lái)催化玉米糖漿和淀粉生產(chǎn)高甜度的高果糖漿。自1972年這技術(shù)產(chǎn)生以來(lái)，科學(xué)家已經(jīng)固定了幾種芽孢桿菌和鏈霉菌中提的葡萄糖異構(gòu)化酶，并大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，今后幾十年中它將是應(yīng)用最廣，市場(chǎng)份額最大的固定化酶。2021/5/9174.1.4固定化酶法脫去柑桔類(lèi)果汁中的苦味柑桔類(lèi)加工產(chǎn)品出現(xiàn)過(guò)度苦味是柑桔加工業(yè)中較重要的問(wèn)題。造成苦味的物質(zhì)主要是二類(lèi)：一類(lèi)為檸檬苦素的二萜烯二內(nèi)酯化合物(A環(huán)和B環(huán))；另一類(lèi)為果實(shí)中多種黃酮苷。脫去苦味的方法有：吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物質(zhì)，而酶法脫苦主要是利用不同的酶分別作用于檸檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物質(zhì)。工廠生產(chǎn)中常采用固定化柚皮苷酶減少柑桔類(lèi)果汁中的柚皮苷含量。Tsen等在1989年使用甲殼素固定柚皮苷酶，并且研究了固定化的動(dòng)力學(xué)因子。Manjon等[14]使用空心玻璃床作為載體，分別在1977年使用DEAE-Sephadex，1978年使用單寧-2-氨基乙基纖維作為載體。1996年P(guān)uri等使用海藻糖，1998年Soures等使用醋酸纖維和三醋酸纖維制成膜固定酶。2021/5/918酶法去除苦味物質(zhì)因?yàn)槊傅纳锘钚蕴卣鞫蛊鋺?yīng)用受到很多限制。為了在不改變底物理化性質(zhì)條件下，使酶保持最大活性，通常要注意以下幾個(gè)問(wèn)題：固定化材料的選擇；固定率；固定化后的酶活性；最適pH值；溫度對(duì)酶活性的影響；酶在不同濃度果汁中受到的抑制作用；酶的保存。2021/5/9194.1.5固定化酶技術(shù)應(yīng)用于食品檢測(cè)固定化酶技術(shù)的發(fā)展使生物傳感器應(yīng)運(yùn)而生。而它的問(wèn)世不僅使食品成分的快速、低成本、高選擇性分析測(cè)定成為可能，而且生物傳感器技術(shù)的持續(xù)發(fā)展將很快實(shí)現(xiàn)食品生產(chǎn)的在線質(zhì)量控制，降低食品生產(chǎn)成本，并給人們帶來(lái)安全可靠及高質(zhì)量的食品。生物傳感器的核心元件就是其分子識(shí)別元件，即由生物活性物質(zhì)經(jīng)固定化后形成的敏感膜。Kurube用酶?jìng)鞲衅鳒y(cè)定了豬肉新鮮度；日本農(nóng)林水產(chǎn)省研制出的滋味傳感器，可品嘗肉湯風(fēng)味，用于肉湯生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制；Fernando采用電導(dǎo)型生物傳感器來(lái)檢查食品中有機(jī)農(nóng)藥的污染。2021/5/9204.2在環(huán)境工程中的應(yīng)用4.2.1用于有機(jī)廢水處理污水處理中常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶、漆酶、酪氨酸酶等。這些酶可降解有機(jī)廢水中毒性很強(qiáng)的酚類(lèi)。利用固定化辣根過(guò)氧化物酶去除污水中的4-氯酚，去除率高達(dá)80%。用殼聚糖微球固定化辣根過(guò)氧化物酶處理含酚廢水，并考察酚濃度對(duì)去除率的影響。研究表明，酚濃度低于100mg/L時(shí)，酚的去除率達(dá)90%以上，隨著酚濃度的增加，酚的去除率逐漸下降。2021/5/921用固定化酶處理受污染水體中的農(nóng)藥也取得了很好的效果。用聚丙烯負(fù)載二氧化鈦膜固定農(nóng)藥降解酶，降解農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷。研究發(fā)現(xiàn)，甲基對(duì)硫磷在30min內(nèi)降解了70%以上。尤其等以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，固定化真菌漆酶對(duì)農(nóng)藥氯苯嘧啶醇進(jìn)行降解。研究認(rèn)為，在酸性條件下，固定化漆酶對(duì)氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。2021/5/922“用于污染水源修復(fù)的固定化酶復(fù)合材料及其制備方法”發(fā)明專(zhuān)利也用到了固定化酶。這種復(fù)合材料造價(jià)低，廣泛應(yīng)用于廢水處理工程，是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用、前景廣闊的新型環(huán)保材料，具有綜合交叉學(xué)科集成創(chuàng)新的特點(diǎn)，為環(huán)保領(lǐng)域水處理工程技術(shù)帶來(lái)嶄新的突破。聯(lián)合固定化技術(shù)使酶的特性得到了更好的發(fā)揮，擴(kuò)展了固定化酶的應(yīng)用范圍。將脫色酶與苯胺降解菌混合固定用來(lái)處理染料廢水。結(jié)果表明，脫色率及苯胺降解率分別達(dá)到80%和90%以上。用苯酚甲醛樹(shù)脂吸附結(jié)晶型枯草桿菌—淀粉酶處理造紙廠廢水，廢水在反應(yīng)器中停留4.5h，可去除廢水中78%的懸浮膠態(tài)淀粉。2021/5/9234.2.2用于環(huán)境污染物的監(jiān)測(cè)由固定化酶制成的酶反應(yīng)器可以直接或與其他檢測(cè)器組成酶電極、酶?jìng)鞲衅鞯确治鰴z測(cè)系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境污染物的監(jiān)測(cè)。由于農(nóng)藥的面源污染、未經(jīng)處理的污水直接灌溉等問(wèn)題，食品中的有毒有害物質(zhì)成為環(huán)境監(jiān)測(cè)對(duì)象。固定化酶技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中有害物質(zhì)的有效檢測(cè)。用固定化草酸氧化酶完成了對(duì)河豚魚(yú)中河豚毒素的快速檢測(cè)。用聚乙烯醇苯乙烯吡啶固定乙酰膽堿酯酶，與搗碎提取設(shè)備、酶標(biāo)儀組合了一套檢測(cè)設(shè)備，對(duì)200多個(gè)蔬菜樣品進(jìn)行了成功的檢測(cè)。2021/5/9244.2.3其他應(yīng)用CO2是一種重要的溫室氣體。目前全球每年排放的數(shù)十億噸CO2需要得到妥善的處置。固定化酶技術(shù)在固定CO2方面也取得了成果。據(jù)報(bào)道，以工業(yè)固體廢棄物為原料，利用固定化碳酸酐酶和超重力強(qiáng)化反應(yīng)可得到CO2的有效固定固定化酶技術(shù)在清潔生產(chǎn)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。固定化的木聚糖酶和漆酶用于紙漿漂白，可以避免產(chǎn)生傳統(tǒng)造紙工藝過(guò)程中用氯漂白產(chǎn)生的難以生物降解的各類(lèi)氯代有機(jī)物。2021/5/925固定化酶技術(shù)還在污水生物處理工藝中得到了應(yīng)用。用大孔樹(shù)脂固定水解酶類(lèi)到兩相厭氧反應(yīng)器中處理黃漿廢水。對(duì)厭氧濾池中的以納米改性陶粒為載體固定化木瓜蛋白酶開(kāi)展研究，都取得了一系列相應(yīng)的成果。2021/5/9264.3固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用溶液酶的應(yīng)用缺陷：酶作為異體物質(zhì)，在體內(nèi)應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)酶是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除和被蛋白質(zhì)酶水解破壞由于稀釋效應(yīng)，藥物酶無(wú)法集中于靶器官組織以達(dá)到治療所需的最適高濃度

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（1）轉(zhuǎn)入體內(nèi)發(fā)揮作用（口服和注入）

口服：最初主要限于消化酶類(lèi)，近年來(lái)也有人嘗試將酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治療?？诜膬?yōu)點(diǎn)是藥物通過(guò)粘膜吸收后能迅速進(jìn)行擴(kuò)散，進(jìn)入體內(nèi)，通常不會(huì)引起免疫反應(yīng)。注入：是最有實(shí)用價(jià)值的一種方式，溶液酶的弱點(diǎn)集中于此方式。固定化酶可很好的地解決這一問(wèn)題，辦法是將藥物酶包埋于半透膜中，可防止藥物酶和蛋白水解酶以及其它免疫因子等直接接觸，因而可延長(zhǎng)酶在體內(nèi)的半衰期和避免免疫過(guò)敏反應(yīng)。2021/5/928

（2）通過(guò)“體外循環(huán)”做成人工臟器

固定化酶也可做成“人工臟器”參與體外循環(huán)，應(yīng)用有兩方面：用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝產(chǎn)物除去氨基酸，使需要這些物質(zhì)的病變組織“餓死”；治療時(shí)只需將患者的血液引出體外，通過(guò)由固定化酶等構(gòu)成的“人工臟器”加以處理，然后再回流體內(nèi)。2021/5/929實(shí)例：

A.消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，無(wú)法長(zhǎng)期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時(shí)間內(nèi)失活。

用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進(jìn)出。2021/5/930B.人工腎

將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用微膠囊固定化脲酶和活性炭組成人工腎。2021/5/9315發(fā)展趨勢(shì)及建議隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，固定化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用日益廣泛，但并不是說(shuō)可以使用酶的地方，都可以用固定化酶來(lái)代替。在使用固定化酶技術(shù)時(shí)，也需要綜合考慮其制備工藝、酶回收率、可操作性、穩(wěn)定性及生產(chǎn)成本等方面的因素。我國(guó)目前食品加工企業(yè)使用該