蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及活力的測定

蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及活力的測定作者劉艷芝 指導(dǎo)教師張玲秀（忻州師范學(xué)院生物系1201班034000）摘要：采用忻州師范學(xué)院校園附近土壤、農(nóng)田土壤及體育場土壤作為樣品，并從中篩選分離并得到產(chǎn)蛋白酶能力較高的菌株，經(jīng)過初步鑒定該菌株屬芽孢桿菌。通過對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示該菌產(chǎn)酶最佳碳源為質(zhì)量濃度15g/L的乳糖，最佳氮源為質(zhì)量濃度20g/L的尿素，最適初始pH值為6.5，最適發(fā)酵溫度為35°C。關(guān)鍵詞：菌種篩選；鑒定；蛋白酶；條件優(yōu)化蛋白酶蛋白質(zhì)中肽鍵水解的酶，是一類廣泛應(yīng)用于皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面的重要工業(yè)用酶，也是目前世界上產(chǎn)銷量最大的商業(yè)酶，其市場占有率約占整個(gè)商品酶銷售量的60%，微生物蛋白酶從微生物中提取，不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有動(dòng)物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比擬的優(yōu)越性。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品種的發(fā)掘，并通過分離篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化和誘變育種或構(gòu)建基因工程菌等綜合手段獲得高產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)良菌株。我國的蛋白酶研究還存在如微生物資源開發(fā)不足，蛋白酶種類較少，酶制劑品種單一等問題。本論文從以下幾方面對蛋白酶產(chǎn)生菌株進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究：從土壤中篩選出產(chǎn)蛋白酶能力較高菌株。對篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定，將菌株初步確定到屬。研究產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件，對培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)酶活力。1、材料及方法：實(shí)驗(yàn)儀器：高壓滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，電子分析天平，pH測量儀，水浴鍋，微波爐，紫外光可見分光光度計(jì)，搖床、酒精燈、接種針、游標(biāo)卡尺、無菌移液管、無菌試管、量筒、容量瓶、漏斗、試劑瓶、漏斗、載玻片、濾紙、擦鏡紙。1.2實(shí)驗(yàn)材料：樣品：取自忻州師范學(xué)院附近的土壤。試劑：無菌水（帶玻璃珠）、100ug/ml酪氨酸溶液、PH8.0硼酸緩沖液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、酪蛋白培養(yǎng)基、產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基二、操作步驟（一） 配制所需培養(yǎng)基按照以下配方配制所需的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基：牛肉膏0.5g，蛋白月東1g，NaCl0.5g，瓊脂1.5?2.0g，水100ml，pH7.2，配制200mL酪蛋白培養(yǎng)基：牛肉膏0.3g，酪素1g，NaCl0.5g，瓊脂2g，定容于100ml產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氫鉀0.03g，碳酸鈉0.1g，磷酸氫二鈉0.4g，定容于100ml（二） 分離洗滌培養(yǎng)皿、試管等實(shí)驗(yàn)器具，與121°C高壓滅菌20min采集土壤樣品，用無菌水植被1:10土壤懸液。取1:10土壤懸液5mL，注入己滅過菌的試管中，將此試管放入75°C恒溫水浴中熱處理10min,以殺死非芽孢細(xì)菌及其他微生物。取加熱處理過的土壤懸液100?200UL，涂布接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板，后將平板倒置，于30?32C下培養(yǎng)24?48h.（三） 篩選1、 從判定為芽孢桿菌的菌落處，分別挑取少許菌苔，接種于酪蛋白培養(yǎng)基，30?32C下倒置培養(yǎng)24?48h。2、 選擇水解圈直徑與菌落直徑比值大的菌，接入產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基30-32C振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，將發(fā)酵液過濾或離心，取清夜檢測蛋白酶活力進(jìn)行復(fù)篩。（四） 蛋白酶活力的測定原理：蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質(zhì)中的肽鍵，也能夠水解酰胺鍵和酯鍵，因此可用蛋白質(zhì)或人工合成的酰胺及酯類化合物作為底物來測定蛋白酶的活力。本實(shí)驗(yàn)選用酪蛋白為底物，測定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力。酪蛋白經(jīng)蛋白酶作用后，降解成相對分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸，在反應(yīng)混合物中加入三氯醋酸溶液，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和肽就沉淀下來，相對分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的數(shù)量正比于酶的數(shù)量和反應(yīng)時(shí)間。在275nm波長下測定溶液吸光度的增加，就可計(jì)算酶的活力。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支試管，按下表加入試劑:項(xiàng)目0123456100ug/ml酪氨酸溶液（ml）00.10.20.30.40.50.6酪氨酸濃度（ug/ml）0102030405060PH8.0硼酸緩沖液6.05.95.85.75.65.55.40.4mol/1三氯乙酸（ml）5555555將各管溶液混勻，40°C預(yù)熱2min，用濾紙過濾，濾液用紫外分光光度計(jì)測定275nm的吸光值，用Excel軟件求回歸方程，并計(jì)算出1ug/ml酪氨酸的吸光值。實(shí)驗(yàn)步驟（1） 取5ml用PH8.0硼酸緩沖液制備的0.6%酪蛋白溶液于試管中，40C保溫20min后加入1：20以PH8.0硼酸緩沖液稀釋的酶液1ml，40C反應(yīng)10min后，加入5ml0.4mol/ml三氯乙酸以終止反應(yīng)，并沉淀殘余底物，40C保溫20min使沉淀完全，用漏斗加濾紙過濾，濾液用紫外分光光度計(jì)測定275nm的吸光值。（2） 空白組先加三氯乙酸使酶失活，后加酪蛋白，按上述同樣步驟測定吸光值。計(jì)算酶活力以1min內(nèi)有酪蛋白釋放的三氯乙酸可溶物在275nm的吸光值于1ug酪氨酸相當(dāng)時(shí)，其所需要的酶量為1個(gè)單位。酶活（U/ml）=Al-A0 xn10xA.A〕-A”

xnIOxA3A1 酶反應(yīng)可溶物的吸光值，A0 空白對照可溶物的吸光值，A2 1ug/ml酪氨酸的吸光值實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析：實(shí)驗(yàn)所測標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)如下：試管號0123456酪氨酸的濃度（ug/ml）0102030405060A275下的吸光值00.0210.0280.0360.0460.0570.073標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制如下:冊白活力的湄亍.I；：o.IV0.II.冊白活力的湄亍.I；：o.IV0.II.一IE(I.1'二40 ￡酪劄段獨(dú)3.國）*女元笙一戲性您壬度;由圖中可知，線性關(guān)系為y=0.0011x+0.0042在實(shí)驗(yàn)