第四章酶的生物有機(jī)化學(xué)

第四章酶的生物有機(jī)化學(xué)第一頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一酶是生物催化劑酶是生物活細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)具有催化功能的生物分子酶的分類(lèi)：按結(jié)構(gòu)：蛋白酶、核酸酶。按來(lái)源：天然酶、人工模擬酶、雜化酶。按功能：氧化酶、水解酶、還原酶、甲基化酶等。第二頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一酶的催化特性高效率：能催化自然條件下難以進(jìn)行的反應(yīng)能使復(fù)雜的反應(yīng)有序可控進(jìn)行能使生物有機(jī)化學(xué)反應(yīng)在常溫常壓和水介質(zhì)中進(jìn)行。能使反應(yīng)速率提高106~1012倍第三頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一高選擇：反應(yīng)專(zhuān)一性：只催化一種或一類(lèi)化學(xué)反應(yīng)。如蛋白水解酶底物專(zhuān)一性：只作用于一種或一類(lèi)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相似的物質(zhì)。

結(jié)構(gòu)專(zhuān)一性：

絕對(duì)專(zhuān)一性：只作用于特定的底物。如脲酶

相對(duì)專(zhuān)一性：作用于一類(lèi)化學(xué)鍵。如胰凝乳蛋白酶

立體專(zhuān)一性：專(zhuān)一性地與手性底物結(jié)合并催化其反應(yīng)。如胰蛋白酶、淀粉酶等

幾何專(zhuān)一性：只催化某種幾何異構(gòu)體底物的反應(yīng)。如延胡索水解酶。

第四頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一遵守米氏(Michaelis-Menten)方程：在底物低濃度時(shí)，反應(yīng)速率與底物濃度成正比．表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征：當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速率達(dá)到最大值．此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速率不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。Km為米氏常數(shù)第五頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一影響酶催化特性的因素酶分子的結(jié)構(gòu)活性部位：包括結(jié)合部位與催化部位。結(jié)合部位：決定酶的專(zhuān)一性。在空間形狀和氨基酸殘基組成上．有利于與底物形成復(fù)合物，起到固定底物，使底物中參加化學(xué)變化的反應(yīng)基團(tuán)相互接近并定向，從而使反應(yīng)具有分子內(nèi)反應(yīng)特點(diǎn)。催化部位：決定酶的高效性。其作用是使底物的價(jià)鍵發(fā)生形變或極化，起到將底物激活和降低過(guò)渡態(tài)活化能作用。調(diào)控部位：可以與底物以外的其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合，從而引起酶分子空間構(gòu)型的變化，對(duì)酶起到激活或抑制作用。第六頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一酶與底物的相互作用靜電引力：正負(fù)帶電基團(tuán)的相互作用。氫鍵：酶與底物含有大量能形成氫鍵的基團(tuán)。疏水鍵：按相似相溶原則，蛋白質(zhì)分子中含有大量的親水性和疏水性基團(tuán)。疏水性基因常常趨向于形成疏水核心。酶分子的活性中心部位，相對(duì)處于一定程度的疏水環(huán)境?；钚灾行牡氖杷I不僅具有維持活性中心空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要作用，而且也是和底物分子中疏水部分結(jié)合的重要作用力之一。第七頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一鄰基參與和定向效應(yīng)分子內(nèi)反應(yīng)與分子間反應(yīng)具有很大的速度差異。K1=0.0018s-1第八頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一與過(guò)渡狀態(tài)的結(jié)合作用酶與反應(yīng)過(guò)渡狀態(tài)的親和能力遠(yuǎn)大于酶與底物或產(chǎn)物的親和能力這種親和力使過(guò)渡態(tài)能量降低，反應(yīng)速度加快。第九頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一多功能催化作用酶的活性中心部位，一般都含有多個(gè)起催化作用的基團(tuán)，這些基團(tuán)在空間有特殊的排列和取向，可以對(duì)底物價(jià)鍵的形變和極化及調(diào)整底物基團(tuán)的位置等起到協(xié)同作用，從而使底物達(dá)到最佳反應(yīng)狀態(tài)。第十頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一手性選擇結(jié)合第十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一酶的非蛋白成分輔酶與酶蛋白結(jié)合在一起協(xié)同實(shí)施催化作用的有機(jī)小分子稱(chēng)輔酶。結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：氧化還原、轉(zhuǎn)移作用特點(diǎn)：直接參與反應(yīng)，種類(lèi)少，各具特殊功能，可與不同的蛋白結(jié)合形成不同的全酶。與維生素的關(guān)系：大部分輔酶的前體是維生素，主要是水溶性的B族維生素。第十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一酶中金屬離子金屬酶：酶蛋白與金屬離子以配位鍵形式緊密結(jié)合。金屬離子作為金屬酶中的輔助因子，起傳遞電子、原子和官能團(tuán)作用。金屬激活酶：酶從溶液中結(jié)合某些金屬離子而激活。常為堿金屬和堿土金屬，結(jié)合較松散，對(duì)酶有一定選擇性。第十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一酶的催化作用機(jī)制催化機(jī)理：通過(guò)形成新的反應(yīng)途徑降低反應(yīng)活化能。第十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一酶催化反應(yīng)機(jī)制類(lèi)型酸堿催化廣義酸堿催化是通過(guò)質(zhì)子酸堿提供或接受質(zhì)子的作用來(lái)降低反應(yīng)活化能。第十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一

許多酶促反應(yīng)同時(shí)包括了廣義酸和廣義堿的催化過(guò)程結(jié)構(gòu)研究(包括應(yīng)用x衍射技術(shù)等)證明，RNaseA活性中心含有兩個(gè)His殘基(His—12和His—l19)，這兩個(gè)His的咪唑基作為廣義的酸和堿在催化過(guò)程中起著重要作用。

第一步：His—12作為一個(gè)廣義堿，從RNA核苷酸殘基的2’—oH中接受一個(gè)質(zhì)子，從而促使2’—oH基上的氧原子親核進(jìn)攻相鄰的磷原子。而His—l19則作為一個(gè)廣義的酸促進(jìn)了3’—5’磷酸酯鍵的斷裂．并形成2’—3’環(huán)磷酸酯中間產(chǎn)物。第二步：2’—3’環(huán)磷酸酯中間產(chǎn)物，可以通過(guò)與第—步反應(yīng)相反的過(guò)程，水解生成3‘—磷酸酯產(chǎn)物，而在這一步中，His—12起廣義酸作用，His—119起廣義堿作用．而酶本身則恢復(fù)到原來(lái)的狀態(tài)。第十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一共價(jià)催化催化劑與底物形成共價(jià)產(chǎn)物，降低活化能，提高反應(yīng)速度。親核共價(jià)催化：催化劑的親核基團(tuán)對(duì)底物進(jìn)行親核進(jìn)攻形成活性中間體。親電共價(jià)催化：催化劑的親電基團(tuán)對(duì)底物進(jìn)行親電進(jìn)攻形成活性中間體。親電基團(tuán)可為非蛋白如金屬離子。形成活性中間體是共價(jià)催化劑的關(guān)鍵。Lys的-NH2可以起伯胺類(lèi)似的反應(yīng)。第十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一金屬離子的催化作用電荷穩(wěn)定作用：作為L(zhǎng)ewis酸，具有高于1價(jià)的正電荷，在中性pH下高濃度存在，金屬往往比質(zhì)子酸更強(qiáng)的酸催化作用。提高水的親核共價(jià)催化作用：金屬離子與水中的OH共價(jià)結(jié)合，提高了水的親核催化性能。第十九頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一電荷屏蔽作用：多種激酶的底物是Mg2+-ATP復(fù)合物，金屬離子屏蔽磷酸基的負(fù)離子。電子傳遞中間體：氧化還原酶中的鐵、銅離子可傳遞電子。第二十頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一絲氨酸蛋白酶水解機(jī)制

絲氨酸蛋白水解酶是一大類(lèi)蛋白水解酶的總稱(chēng)。這類(lèi)酶的特征是酶的活性中心都含有ser殘基，并具有相似的催化作用機(jī)制。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶都屬于消化酶系。它們?cè)谝认侔麅?nèi)合成，并分泌到十二指腸中。這幾種酶都能催化肽鏈的水解反應(yīng)，僅對(duì)肽鍵的選擇性有所不同。第二十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一水解作用的動(dòng)力學(xué)模型

以乙酸對(duì)硝基苯酚酯酶促水解為模型動(dòng)力學(xué)研究表明，本反應(yīng)過(guò)程具有兩相特征(1)快速反應(yīng)相：水解產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚離子快速形成，并與活性酶的量成正比。(2)‘恒態(tài)反應(yīng)相：水解產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚離子以一種比較慢的，但是恒定的速率形成。反應(yīng)速率大小與底物濃度無(wú)關(guān)。這是決定反應(yīng)速率的步驟。第一階段酶和底物快速結(jié)合并作用，釋放出對(duì)硝基苯酚離子．同時(shí)形成共價(jià)結(jié)合的乙?；钢虚g體。第二階段是乙?；嘎偎夥磻?yīng)，釋放出乙?；３鲇谶@—步反應(yīng)速率慢，使反應(yīng)體系中酶有效濃度大大下降，因而使整個(gè)酶促反應(yīng)速率也顯著下降。決定肽鍵水解速度的步驟是第一步。第二十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一酶活性中心重要催化活性基團(tuán)的測(cè)定(1)活性Ser的測(cè)定：二異丙基磷酸氟（DIPF)能特異性地與活性中心Ser的一OH基反應(yīng)：反應(yīng)結(jié)果導(dǎo)致酶的不可逆失活。而其他非活性中心的Ser殘基則不發(fā)生上述反應(yīng)。應(yīng)用這一方法已經(jīng)確定胰凝乳蛋白酶中的ser—195是酶活性中心的活性氨基酸殘基。DIPF第二十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一

(2)活性His的測(cè)定：胰凝乳蛋白酶活性中心的His—57是另一個(gè)重要的催化活性基團(tuán)。TPCK能夠特異性地與胰凝乳蛋白酶中的His殘基結(jié)合。本反應(yīng)可以被β-苯基丙酸抑制。因?yàn)門(mén)PCK具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)。TPCK也不能與DIP胰凝乳蛋白酶中心的His—57作用。表明胰凝乳蛋白酶的活性中心已被DIP基團(tuán)占據(jù)。第二十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一x衍射方法測(cè)定酶的空間結(jié)構(gòu)

用x衍射方法已經(jīng)分別測(cè)定了胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶的結(jié)構(gòu)。它們的空間結(jié)構(gòu)有許多相似之處?；敬呋罴鶊F(tuán)ser—159和His—57都位于底物結(jié)合部位，并且都與另外一個(gè)活性基因Asp—302相接近。這二個(gè)氨基酸殘基通過(guò)氫鍵形成了一個(gè)“催化三元區(qū)”第二十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一催化作用機(jī)制(1)形成一個(gè)四面體結(jié)構(gòu)的中間物：胰凝乳蛋白酶催化肽鍵水解的反應(yīng)基本上是按共價(jià)催化機(jī)制進(jìn)行的。反應(yīng)的第一步是酶中Ser—195的羥基與His—57咪唑基的親核N原子形成氫鍵，增強(qiáng)了羥基的親核性能。ser—195的羥基對(duì)底物肽鍵的?；鲇H核進(jìn)攻．然后形成一個(gè)Michaelis復(fù)合物——包括Ser—195羥基、底物?；?、氨基在內(nèi)的一個(gè)共價(jià)四面體中間物。Asp—102的作用是不容忽視的，當(dāng)用Asn取代Asp—102時(shí)(用定點(diǎn)基因突變技術(shù))發(fā)現(xiàn)，雖然酶與底物結(jié)合情況變化不大(Km值在中性條件下幾乎不變)，但催化活性只及原酶的005%.第二十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一(2)形成?；钢虚g物：反應(yīng)的第二步是四面體中間物分解形成另一個(gè)中間物——?；钢虚g物，并伴隨著c—N鍵斷裂的過(guò)程：推動(dòng)這步反應(yīng)的作用力主要來(lái)自His—57中N3給出質(zhì)子的能力。第二十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（3）?；钢虚g物解離：?；钢虚g體解離過(guò)程中，His—57作為廣義酸起催化作用。第二十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一(4)酶活性中心Asp—102，His—57和Ser—195的三元催化體系；第二十九頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一(5)酶的活性中心與底物過(guò)渡狀態(tài)的最優(yōu)化締合方式：全面研究和比較了幾種絲氨酸蛋白水解酶的x衍射結(jié)構(gòu)以后，發(fā)現(xiàn)酶活性中心與底物過(guò)渡狀態(tài)具有最優(yōu)締合方式，這是酶催化活性的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。由于四面體中間物變形、移動(dòng)，使得酶與肽鍵斷裂部位附近的其他基團(tuán)也能形成氫鍵，所以酶既可以與Michaelis中間物，也可以與?；钢虚g物以最優(yōu)方式締合。酶的活性中心對(duì)底物過(guò)渡狀態(tài)的最優(yōu)締合方式，是酶具有高效催化活性的主要因素之一。事實(shí)上，DIPF對(duì)于絲氨酸蛋白水解酶的高度抑制性質(zhì)，就是由于它的四面體磷酸酯基在結(jié)構(gòu)上與底物的過(guò)渡狀態(tài)相似。第三十頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一(6)胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和它們的水解選擇性在肽鍵選擇性上所表現(xiàn)出來(lái)的明顯差異，是由于它們活性中心結(jié)合部位結(jié)構(gòu)有所不同。胰凝乳蛋白酶的結(jié)合部位有一個(gè)Ser殘基，這個(gè)結(jié)合部位實(shí)際上是一個(gè)疏水性大口袋，可以與側(cè)鏈為芳香基團(tuán)的氨基酸殘甚結(jié)合；胰蛋白酶的結(jié)合部位雖然與胰凝乳蛋白酶相似，但由一個(gè)帶負(fù)電荷的Asp代替Ser，因此與氨基酸殘基結(jié)合性質(zhì)發(fā)生了很大變化，只能與帶有正電荷的氨基酸殘基如Lys、Arg結(jié)合。彈性蛋白酶的結(jié)合部位入口處有兩個(gè)較大的val和Thr存在，只能讓側(cè)鏈體積小的氨基酸殘基如Glg和Ala等進(jìn)人。第三十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.5酶催化活性的調(diào)控和酶的抑制作用1．酶催化活性的生物學(xué)調(diào)控

(1)動(dòng)力學(xué)調(diào)控：酶的催化反應(yīng)速率與酶的濃度、底物的濃度、酶與底物的結(jié)合狀態(tài)、酶與產(chǎn)物的結(jié)合狀態(tài)以及產(chǎn)物的濃度等動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)。

①酶的濃度調(diào)控：酶在細(xì)胞內(nèi)的含量取決于酶的合成速率和分解速率。細(xì)胞根據(jù)白身運(yùn)動(dòng)需要．嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)某種酶的合理含量。例如，大腸桿菌培養(yǎng)過(guò)程中如果缺少乳糖，那么細(xì)胞中就不含任何可以代謝乳糖的酶。但是在培養(yǎng)基中加人乳糖后，只要過(guò)幾分鐘，細(xì)胞就能合成出乳糖水解酶，以便能利用這種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。這種調(diào)控能力對(duì)于生物體適應(yīng)不同的環(huán)境具有重要意義。②產(chǎn)物濃度水平調(diào)控和變構(gòu)調(diào)控：在某些生物合成反應(yīng)中，最終產(chǎn)物往往會(huì)對(duì)合成反應(yīng)起抑制作用。當(dāng)產(chǎn)物濃度達(dá)到一定程度時(shí)，可自動(dòng)抑制反應(yīng)進(jìn)行。而反應(yīng)產(chǎn)物濃度下降到一定水平后，又可恢復(fù)合成反應(yīng)。這種調(diào)控作用又稱(chēng)為“反饋抑制調(diào)控”。第三十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一(2)共價(jià)修飾調(diào)控：某些酶的激活作用是通過(guò)共價(jià)修飾而實(shí)現(xiàn)的。例如．肌肉中存在一種能催化糖原的合成和分解的酶，即磷酸化酶b。該酶本身的活性很低，當(dāng)磷酸化酶b活性中心的絲氨酸殘基被磷酸化后，即形成高活性磷酸化酶。由磷酸化酶b轉(zhuǎn)化為活化形式a的反應(yīng)，被磷酸化酶激酶所催化，而磷酸化酶a去活化則由另一種磷酸水解酶所催化。第三十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一

(3)水解活化：有些酶在通常情況下是以非活化形式存在的。某些消化酶，如胰蛋白酶原即屬這類(lèi)酶。當(dāng)胰蛋白面原分子中某一個(gè)肽鍵被水解后，即轉(zhuǎn)變成活性的胰蛋白酶。第三十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一2．酶活性的化學(xué)調(diào)控和抑制劑(1)抑制劑的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特點(diǎn)：

a．在化學(xué)結(jié)構(gòu)上(包括分子大小、形狀、官能團(tuán)等)．與被抑制的底物分子或底物的過(guò)渡狀態(tài)相似；b．能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合體。

(2)抑制劑的作用方式：

a.不可逆抑制：抑制劑與酶的反應(yīng)中心的活性基團(tuán)以共價(jià)形式結(jié)合引起酶的永久性失活。例如，前面提到DIPF對(duì)絲氨酸蛋白水解酶酌抑制作用即屬這—類(lèi)。

b.可逆抑制：抑制劑與酶蛋白以非共價(jià)鍵結(jié)合，引起酶活性暫時(shí)性喪失,抑制劑可以通過(guò)透析、過(guò)濾等方法除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性。競(jìng)爭(zhēng)性抑制:某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能和底物競(jìng)爭(zhēng)與酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。競(jìng)爭(zhēng)性抑制通?？梢酝ㄟ^(guò)增大底物濃度來(lái)消除。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：酶可以同時(shí)與底物和抑制劑結(jié)合，兩者沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通常與酶的調(diào)控部位結(jié)合，這種結(jié)合將引起酶分子構(gòu)型變化，導(dǎo)致酶活性下降：如某些金屬離子(Cu+，Ag+，Hg+‘)等，通常能與酶分子中的調(diào)控部位中的一sH基團(tuán)等作用．改變酶的空間構(gòu)型，引起非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。第三十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.5酶的作用機(jī)制與生物活性分子的設(shè)計(jì)1．酶的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制是設(shè)計(jì)生物活性分子的基礎(chǔ)。生物活性物質(zhì)，主要是指能夠影響酶的結(jié)構(gòu)及其功能的一類(lèi)化學(xué)物質(zhì)。酶的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制、酶與生物活性物質(zhì)之間的相互作用及其影響是進(jìn)行生物活性分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)第三十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一2、具有抗β—內(nèi)酰胺水解酶的青霉素青霉素的作用機(jī)制是抑制細(xì)菌的細(xì)胞壁生物合成第三十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一

由于青霉素在結(jié)構(gòu)上與轉(zhuǎn)胺酶的天然底物肽聚糖的反應(yīng)部位相似，所以能競(jìng)爭(zhēng)性地與轉(zhuǎn)胺酶的活性中心結(jié)合(與活性中心的絲氨酸殘基形成共價(jià)鍵)，從而抑制了細(xì)胞壁的合成。

應(yīng)用青霉素菌發(fā)酵得到的青霉素，主要成分是青霉素G，它的抗菌效果好，但是，容易被胃酸水解，口服效果差。后來(lái)發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵生產(chǎn)青霉素時(shí)，加入N—(2—羥基)苯氧乙酰胺做前體，可以得到另一種青霉素v。青霉素v能耐胃酸．適于口服。第三十九頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一

青霉素在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期使用以后，能夠誘導(dǎo)生物體(包括細(xì)菌等微生物)產(chǎn)生青霉素酶，它能夠水解β—內(nèi)酰胺環(huán)，從而導(dǎo)致青霉素失效。

(1)研制對(duì)青霉素酶不敏感的青霹素新品種：青霉素G和v都是青霉素酶的良好底物，青霉素酶能夠水解β—內(nèi)酰胺環(huán)，從而導(dǎo)致青霉素失效。改變青霉素分子中的R基或噻唑環(huán)的結(jié)構(gòu)，可影響青霉素分子與青霉素酶的結(jié)合。具有與青霉親G和v相似的抗茵活性，但是對(duì)青霉素酶不敏感先鋒霉素青霉素酶催化先鋒霉素的水解速率要比催化青霉素v的水解速率小將近150倍oxacillin第四十頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一(2)研制對(duì)青霉素酶具有抑制作用的青霉素產(chǎn)品本身并沒(méi)有顯著的抗菌活性，但它對(duì)青霉素酶則是一種非常好的非可逆抑制劑clavulanicacid既具有抑制青霉素酶作用，又具有良好抗茵活性第四十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一3．具有抗癌活性的生物還原烷基化劑抑制癌細(xì)胞的繁殖是治療癌癥的關(guān)鍵第四十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一好的生物還原烷基化劑，結(jié)構(gòu)上應(yīng)該是多官能團(tuán)的化合物，必須有一個(gè)容易被還原的基團(tuán)，有一個(gè)以上易離解基團(tuán)．以及其他的能夠促進(jìn)還原或離解的基團(tuán)。它能夠被酶催化還原活化、并形成一個(gè)很容易發(fā)生烷基化反應(yīng)的活性中間體(如甲烯醌)第四十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一4降高血壓新藥血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑血壓產(chǎn)生的原因是由于一種稱(chēng)為血管緊張肽的多肽能引起血管的收縮和刺激腎上腺皮質(zhì)激素分泌。血管緊張肽l是由血管緊張肽原經(jīng)過(guò)血管緊張肽原酶選擇性水解后得到的10肽。血管緊張肽Ⅱ是已知的一種最強(qiáng)的內(nèi)源性產(chǎn)生高血壓的物質(zhì)第四十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一人們發(fā)現(xiàn)．有幾種蛇毒對(duì)ACE有很好的抑制作用。其中一個(gè)9肽化合物(SQ20881)具有明顯的降低血壓作用。但是這個(gè)化合物只能注射，口服無(wú)效，因而藥用價(jià)值受到很大的限制。ACE是一種含鋅二肽外切酶羧肽酶A的強(qiáng)抑制第四十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一4．7非蛋白生物催化劑——核酸酶核酸酶的發(fā)現(xiàn)是研究核糖核酸酶—P(RNase—P)作用機(jī)制的結(jié)果。RNase—P作用是能將tRNA的前體水解切去一部分核苷酸鏈，得到活性tRNA。RNase—P由蛋白質(zhì)和RNA織成。開(kāi)始人們認(rèn)為其中的蛋白質(zhì)組分應(yīng)該是活性郎分，而RNA只是輔助成分。Altman等人在詳細(xì)研究了RNase—P作用機(jī)制后，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常重要的現(xiàn)象：RNase—P的蛋白部分本身并不具有任何催化功能，而其中的RNA部分在有足夠濃度Mg2+離子存在情況下，能起核酸水解酶的作用。而RNase—P中的蛋白質(zhì)部分，則起著增加活性作用。這種RNA催化的反應(yīng)遵守米氏動(dòng)力學(xué)原則。第四十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一差不多在同一時(shí)期，Cech等人也提出了RNA可以作為催化劑的證據(jù)。原生動(dòng)物四膜蟲(chóng)中含有一種核蛋白R(shí)NA前體。其組成除了核蛋白體rRNA外，還有—個(gè)由423個(gè)核苷酸組成的插入序列。在研究從Pre—rRNA切去插入序列形成rRNA過(guò)程中，他們發(fā)現(xiàn)這是一個(gè)自催化剪接過(guò)程。所以Pre-rRNA是一種具有自催化性能的核酸酶。核酸酶的發(fā)現(xiàn)，證明了核酸既是信息分子．又是功能分子，對(duì)于研究生命的起源，了解核酸新功能具有重要意義第四十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一核酸酶制備新途徑

定向分子進(jìn)化技術(shù)的出現(xiàn)，為核酸酶的制備開(kāi)辟了一條新的途徑。1992年，JoyceGF報(bào)道了制備具有能夠切割DNA的新型核酸酶方法。他們先選擇一種已知的核酸酶(從四膜蟲(chóng)中分離，具有自催化剪接功能)作為母體。應(yīng)用定向分子進(jìn)化技術(shù)．通過(guò)復(fù)制、突變和擴(kuò)增．獲得將近1013個(gè)各種不同的RNA突變分子。讓它們作用于DNA，發(fā)現(xiàn)有極少一部分突變RNA個(gè)體表現(xiàn)出具有切割DNA的性能。經(jīng)篩選出來(lái)的突變RNA，再經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、突變和篩選，最后得到了具有切割DNA特性的新型核酸酶：第四十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一核酸酶的催化性質(zhì)已知核酸酶的作用底物基本上都是RNA分子，即RNA作用于RNA。核酸酶催化的反應(yīng)主要包括：水解反應(yīng)(RNA限制性?xún)?nèi)切酶活性)，連接反應(yīng)(聚合酶活性)和轉(zhuǎn)核苷酰反應(yīng)等。最近核酸酶的其他作用底物也巳被發(fā)現(xiàn)，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。這表明核酸酶很可能具有氨基酸酯酶、氨酰tRNA合成酶和肽基轉(zhuǎn)移酶活性。由于這些反應(yīng)均與蛋白質(zhì)的生物合成有關(guān)。因此核酸酶在核酸的翻譯、表達(dá)和核糖體功能中有可能起著重要作用。式中為水解位點(diǎn)，UUU為目前已經(jīng)得到的最小的核酸酶第四十九頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一4．8抗體酶和雜化酶1．抗體酶(1)抗體酶的理論基礎(chǔ)①抗體蛋白的特性：酶與抗體這兩種蛋白質(zhì)之間盡管功能不同，但也存在許多相似之處尤其是它們與各自的配基(酶—底物、抗體—抗原)的結(jié)合特件，如結(jié)合方式、動(dòng)力學(xué)過(guò)程等都非常相似。所以，從20世紀(jì)60年代起，就有人開(kāi)始試圖對(duì)抗體進(jìn)行修飾，并使其獲得酶的屬性的研究。②酶活性中心與底物形成過(guò)渡態(tài)理論：酶在催化底物發(fā)生化學(xué)變化過(guò)程中，處于酶活性中心的活性基團(tuán)與底物相互作用形成穩(wěn)定的過(guò)渡狀態(tài)，從而大大降低了反應(yīng)的活化能?？梢栽O(shè)想，如果構(gòu)建一個(gè)對(duì)某種過(guò)渡狀態(tài)具有最佳締合狀態(tài)的抗體，就有可能觀察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的效果。第五十頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一〔2)抗體酶的制備①過(guò)渡狀態(tài)類(lèi)似物(半抗原)的構(gòu)建：根據(jù)酶催化作用機(jī)制，人們有可能設(shè)計(jì)構(gòu)建一個(gè)底物的過(guò)渡狀態(tài)的化學(xué)模型。實(shí)際上由于準(zhǔn)確的過(guò)渡狀態(tài)很難確定或難以合成，因此，制備抗體酶時(shí)用的半抗原是一個(gè)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，在價(jià)鍵取向、電荷分布等都與過(guò)渡態(tài)相似的類(lèi)似物第五十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一

②抗原的制備：將人工設(shè)計(jì)并構(gòu)建的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物(半抗原)，用化學(xué)方法經(jīng)間隔基與載體蛋白相連．即形成一個(gè)抗原。

③應(yīng)用單克隆抗體篩選技術(shù)制備抗體酶：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)重要的生物技術(shù)。我們知道，當(dāng)一個(gè)抗原，如一種蛋白質(zhì)注射到動(dòng)物體內(nèi)后，動(dòng)物血液即產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。但是，在已經(jīng)產(chǎn)生抗體的血清中，可能含有多種能與抗原作用的抗體。而血清本身也含有它原有的抗體。因此，人們無(wú)法從血清中得到單一的抗體，當(dāng)然也就更談不上大量復(fù)制這種抗體。人們發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物脾臟中有一種稱(chēng)為淋巴細(xì)胞B的細(xì)胞，它能產(chǎn)生并分泌出唯一的一種抗體。但是，淋巴細(xì)胞B在通常細(xì)胞培養(yǎng)條件下不能繁衍，所以難以用這一技術(shù)制備大量單一抗體。單克隆抗體技術(shù)的關(guān)鍵是將分離純化的骨髓瘤細(xì)胞在培養(yǎng)條件下與淋巴細(xì)胞B融合生成一種特殊的雜交瘤細(xì)胞，這種雜交瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生單一的抗體，又能夠在細(xì)胞培養(yǎng)條件下快速繁殖．因而可以大量制備單一抗體。將半合成的抗原給小鼠免疫注射和單克隆篩選，獲得單克隆抗體。對(duì)制備好的單克隆抗體進(jìn)行催化活性篩選，即可找到對(duì)碳酸酯具有水解催化活性的抗體酶。由此產(chǎn)生的抗體酶具有酶的屬性。它具有很高的專(zhuān)一性，例如，用對(duì)硝基磷酸酯半抗原產(chǎn)生的抗體，只能水解對(duì)位硝基取代的碳酸酯，而對(duì)鄰位取代物無(wú)效?？贵w酶也具有明顯催化活性，如schultz等制備的抗體酶催化水解速率提高了12000倍，其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)符合米氏方程。第五十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第五十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第五十四頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第五十五頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第五十六頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第五十七頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一(3)抗體酶的發(fā)展前景抗體酶的出現(xiàn)雖然只有短短的十多年時(shí)間，但是已經(jīng)清楚地表明它是研究酶的作用機(jī)制的一個(gè)有力的工具，在此之前，對(duì)于酶催化作用過(guò)渡態(tài)理論的依據(jù)，主要是來(lái)自酶抑制作用機(jī)制的研究結(jié)果。抑制劑只能提供酶作用過(guò)程中的專(zhuān)一性結(jié)合的信息，但不能給出結(jié)合后發(fā)生的催化過(guò)程信息：而在抗體酶研究過(guò)程中，可以直接觀察到過(guò)渡態(tài)理論對(duì)抗體酶設(shè)汁所起到的重要作用。這也就為酶的過(guò)渡態(tài)理論的正確性提供了一個(gè)有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。另一方面，抗體酶在有機(jī)合成和有機(jī)反應(yīng)機(jī)制研究方面，也引起了有機(jī)化學(xué)家的廣泛興趣?？贵w酶的應(yīng)用，使過(guò)去很多不能應(yīng)用酶促反應(yīng)的有機(jī)合成得以實(shí)現(xiàn)。所以，抗體酶的發(fā)展前景是令人鼓舞的。第五十八頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一雜化酶雜化酶是一種半合成酶，它是以天然蛋白為母體，用化學(xué)方法引進(jìn)適當(dāng)活性部分，從而形成一種新的”人工酶”。雜化酶可分為兩種類(lèi)型：一類(lèi)是以具有特異性識(shí)別功能的蛋白(如抗體)，引進(jìn)具有催化功能部分：另一類(lèi)是以具有催化活性的蛋白(非專(zhuān)一選擇性晦)為母體，引進(jìn)具有特殊識(shí)別功能的部分。第五十九頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一(1)抗體雜化酶：利用抗體蛋白作為母體，引入適當(dāng)?shù)拇呋罴行模菢?gòu)建雜化酶的一個(gè)可行途徑。其基本方法是用化學(xué)方法將一個(gè)催化活性基團(tuán)(帶有雙向可反應(yīng)基團(tuán))引進(jìn)抗原類(lèi)似物中。利用抗體蛋白與抗原類(lèi)似物親和結(jié)合作用，使催化活性基團(tuán)與抗體結(jié)合部位附近氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合，然后將催化活性基團(tuán)與抗原類(lèi)似物分離，并將抗原類(lèi)似物從抗體的結(jié)合部位除去。通常被引進(jìn)的活性基團(tuán)是一sH基或咪唑基。第六十頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一〔2)核酸水解雜化酶：準(zhǔn)確地定位并切割DNA和RNA是基因重組和基因圖譜建立的關(guān)鍵。迄今為止，只有為數(shù)不多的天然限制性?xún)?nèi)切酶能夠做到這一點(diǎn)，局限性很大。核酸水解雜化酶是以非選擇性的具有水解DNA或RNA磷酸二酯鍵性質(zhì)的核酸水解酶為母體，在酶的活性中心鄰近位點(diǎn)引進(jìn)—個(gè)識(shí)別部分，如一段寡聚核苷酸等，從而成為能夠?qū)怂徇M(jìn)行定位切割的雜化核酸酶。①識(shí)別部分——寡聚核苷酸鏈的構(gòu)建：能滿足對(duì)DNA或RNA進(jìn)行定位切割的識(shí)別部分，只能是特殊構(gòu)建的寡聚核苷酸鏈。這種寡聚核苷酸鏈必須滿足兩個(gè)條件：一是能與被切割位點(diǎn)附近的核苷酸鏈完全互補(bǔ)；二是寡聚核苷酸鏈的一個(gè)端基(靠近被切割位點(diǎn))核苷酸含有—個(gè)能與催化部分結(jié)合的活性基團(tuán)。通常是用DNA固相合成法來(lái)合成這種特殊的寡聚核苷酸鏈，活性端基一般是含有一SH基的脫氧胸苷。②催化部分——核酸水解酶的選擇和修飾：選擇葡萄球菌核酸水解酶作為催化部分母體是比較理想的。它是—種性質(zhì)比較穩(wěn)定，含有149個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽酶，而在它的分子中，沒(méi)有游離的半胱氨酸，也沒(méi)有鏈間的二硫鍵。它能水解DNA或RNA的磷酸二酯鍵，生成3’-O-PO32-和5’-OH的端基產(chǎn)物。同時(shí)這種酶對(duì)被水解的核苷酸殘基沒(méi)有特別的選擇性。為了要將葡萄球菌核酸水解酶與識(shí)別部分共價(jià)結(jié)合，還必須對(duì)該酶活性部位進(jìn)行修飾。其目的是引進(jìn)一個(gè)-SH基。方法是應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)，將葡萄球菌核酸水解酶中的Lys-116換成Cys-116。得到的突變酶(K116c)是一個(gè)雙體酶(兩個(gè)單體酶中的Cys之間形成二硫健)，再經(jīng)過(guò)DTT還原可以得到單體突變酶。單體突變酶的活性區(qū)含有一個(gè)一SH基，但它的性質(zhì)，如催化性能和Km值等，都與野生型酶很接近。

③核酸水解雜化酶的合成：將單體突變酶與3’-S-thiopyridyloligonucleotide在溫和氧化條件下．通過(guò)形成二硫鍵得到目標(biāo)核酸水解雜化酶。第六十一頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第六十二頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第六十三頁(yè)，共六十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一④核酸水解雜化酶的選擇性切割性質(zhì)：在圖4—26中，底物是一個(gè)5-32P端基標(biāo)記的人工合成DNA。它含有64個(gè)核苷酸殘基，其中有一段的核苷酸順序與核酸水解雜化酶的識(shí)別部分完全互補(bǔ)。圖4—26(b)所