第六章免疫比濁分析演示

（優(yōu)選）第六章免疫比濁分析當(dāng)前第1頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)免疫比濁分析是將液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)與現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動分析技術(shù)相結(jié)合的一項(xiàng)分析技術(shù)。當(dāng)前第2頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)第二節(jié)自動化免疫比濁分析第一節(jié)免疫比濁的原理一、透射免疫比濁法二、散射免疫比濁法三、免疫膠乳比濁法四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用當(dāng)前第3頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)第一節(jié)免疫濁度分析原理

抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。這種濁度可用儀器檢測，用吸光度表示。當(dāng)前第4頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)第一節(jié)免疫濁度分析原理

在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。

當(dāng)前第5頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)免疫比濁技術(shù)分類：透射免疫比濁法（turbidimetricimmunoassay）散射免疫比濁法（nephelometryimmunoassay）速率散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法當(dāng)前第6頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第7頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)一定波長的入射光線通過抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí)，由于溶液中的免疫復(fù)合物微粒對光線的吸收、反射和折射而使透射光減少，可用吸光度表示。在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。一、免疫透射比濁法（一）原理：當(dāng)前第8頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)曲線當(dāng)前第9頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。（二）操作方法2.將待測標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液（5個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品）與適當(dāng)過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應(yīng)完成后，在340nm處測定各管吸光度。

3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進(jìn)行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計(jì)算機(jī)處理，計(jì)算出抗原濃度。當(dāng)前第10頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)待測的抗原抗體復(fù)合物分子量足夠大。抗原抗體復(fù)合物數(shù)量足夠多。具有充分的反應(yīng)時(shí)間，只能測定抗原抗體反應(yīng)的第二階段。高親和力的抗體，并保證抗體過量。（三）技術(shù)要求

當(dāng)前第11頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)（四）方法評價(jià)

優(yōu)點(diǎn):靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確

不足:

①抗體用量較大；②溶液中存在的抗原－抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大③透射比濁測定在抗原－抗體反應(yīng)的第二階段，檢測需在抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后進(jìn)行，耗時(shí)較長。

當(dāng)前第12頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強(qiáng)度、測量角度等因素密切相關(guān)。二、免疫散射比濁法(一)原理當(dāng)前第13頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)不同大小的微粒形成的散射光分布不同。當(dāng)微粒直徑小于入射光的波長的十分之一時(shí)，散射光的強(qiáng)度在各個(gè)方向的分布均勻一致，稱Rayleighae散射。當(dāng)微粒直徑大于或等于入射光的波長時(shí)，前向散射光遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于后向散射光，稱Mile散射。當(dāng)前第14頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第15頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。當(dāng)固定檢測角度與發(fā)射光的波長時(shí)，散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比，即待測的抗原越多，形成的復(fù)合物越多，散射光就越強(qiáng)。當(dāng)前第16頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)

應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓庠磸?qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、測量角度及光源的波長。另外，要注意保證抗原濃度合適。此外，還要選擇適宜的離子強(qiáng)度、pH值等。(二)技術(shù)要求當(dāng)前第17頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動態(tài)測定方法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各時(shí)間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測僅1～2min即可完成。

(三)速率散射比濁法（ratenephelometry）當(dāng)前第18頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)累計(jì)時(shí)間復(fù)合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500—512359080706055453020

抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)間與速率的關(guān)系當(dāng)前第19頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)抗體的濃度固定于一定范圍時(shí)，復(fù)合物形成的速率峰值的高低與抗原的含量成正比，隨著時(shí)間的延長，免疫復(fù)合物的量逐漸增多，抗原抗體結(jié)合速度的峰值在一定的時(shí)間出現(xiàn)。通過微機(jī)處理即可得到待測蛋白成份的含量。當(dāng)前第20頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第21頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)

速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時(shí)間與抗體濃度及純度直接相關(guān)，需選用抗體純度及親和力交高的試劑。此外，要保證待測樣本血清的性狀符合要求，如嚴(yán)重脂血等即為不合格樣本。技術(shù)要求當(dāng)前第22頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)(三)方法評價(jià)散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點(diǎn)。采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴,對抗體的質(zhì)量要求很高。當(dāng)前第23頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2μm），在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚

，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。三、免疫膠乳比濁法（一）原理：當(dāng)前第24頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)三、免疫膠乳比濁法（一）原理：當(dāng)前第25頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)第二節(jié)自動化免疫比濁分析當(dāng)前第26頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)（一）BN特種蛋白分析測定系統(tǒng)該系統(tǒng)的測定方法是透射免疫比濁法的一種改良。以發(fā)光二極管作為光源，檢測前向角13～24度的散射光，然后利用硅化光電二極管接收散射光信號，經(jīng)過微電腦處理，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的濃度。一、主流免疫比濁設(shè)備概況1.測定原理當(dāng)前第27頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)系統(tǒng)由分析儀、計(jì)算機(jī)、條碼讀取器、打印機(jī)四部分組成，其中分析儀是主要組成部分，包括散射測濁儀、自動加樣系統(tǒng)、運(yùn)輸裝置和比色杯裝置。

2.儀器基本組成當(dāng)前第28頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)BNⅡ、BN100特種蛋白分析分析系統(tǒng)當(dāng)前第29頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)本系統(tǒng)屬于速率散射比濁分析法，在抗體過量的前提下，光束通過抗原抗體復(fù)合物時(shí)所產(chǎn)生的散射光速率變化大小與抗原濃度成正比。速率的峰值通過電腦處理系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成待測抗原的濃度。1.測定原理（二）ARRAY分析系統(tǒng)當(dāng)前第30頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)ARRAY系統(tǒng)由分析儀、電腦處理系統(tǒng)、打印機(jī)構(gòu)成，其主要構(gòu)成部分為分析儀，由加液系統(tǒng)、散射測濁儀、40孔樣本轉(zhuǎn)盤、20孔試劑轉(zhuǎn)盤、軟盤驅(qū)動器等組成。2.儀器基本組成當(dāng)前第31頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)Array360、IMMAGE特種蛋白分析分析系統(tǒng)當(dāng)前第32頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)二、免疫比濁分析的主要影響因素1．抗原抗體比例抗原抗體比例要適當(dāng)。2．抗體的純度與效價(jià)診斷試劑應(yīng)盡可能選擇高純度與高效價(jià)的抗體。3．免疫復(fù)合物的大小及穩(wěn)定性溶液中免疫復(fù)合物顆粒的分散度盡可能相同，顆粒應(yīng)該不容易相互聚集。當(dāng)前第33頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)4．增聚劑利用增聚劑破壞抗原抗體的水化層，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。5.離子強(qiáng)度PBS是較好的反應(yīng)液。返回章目錄當(dāng)前第34頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)抗原過量檢測

(1)抗體適當(dāng)過量

(2)對抗原過量進(jìn)行閾值限定當(dāng)前第35頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第36頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)

免疫比濁分析法主要用于特定蛋白系列檢測。如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ鏈、λ鏈、免疫球蛋白亞類；補(bǔ)體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅藍(lán)蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、，C-反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。

三、臨床應(yīng)用當(dāng)前第37頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)小結(jié)

經(jīng)典的免疫沉淀反應(yīng)通常是在抗原抗體反應(yīng)的終點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果判斷，存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、敏感度低及難以自動化等缺陷。自動化免疫比濁分析儀器的問世解決了以上的諸多問題。當(dāng)前第38頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)目前，透射免疫比濁法和散射免疫比濁等方法已常規(guī)運(yùn)用于臨床特定體液蛋白質(zhì)的檢測，相關(guān)儀器已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)各級醫(yī)院，成為臨床免疫檢測的重要手段之一。返回章目錄當(dāng)前第39頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)思考題

1.名詞解釋：透射免疫比濁法、散射免疫比濁法2.免疫比濁分析的基本原理是什么？有哪些類型？3.簡述免疫比濁分析的主要影響因素。當(dāng)前第40頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)一、選擇題1.速率散射比濁法之所以能比傳統(tǒng)的沉淀反應(yīng)試驗(yàn)大大地縮短時(shí)間，主要是因?yàn)锳.在抗原抗體反應(yīng)的第一階段判定結(jié)果B.不需復(fù)雜的儀器設(shè)備C.使用低濃度的瓊脂或瓊脂糖D.反應(yīng)的敏感度高當(dāng)前第41頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)2.透射免疫比濁法A.測定光線通過反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC反射的光的強(qiáng)度B.測定光線通過反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC折射的光的強(qiáng)度C.測定光線通過反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC吸收的光的強(qiáng)度D.測定光線通過反應(yīng)混合液時(shí)，透過的光的強(qiáng)度3.散射免疫比濁法檢測的原理A.測定光線通過反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC反射的光的強(qiáng)度B.測定光線通過反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC折射的光的強(qiáng)度C.測定光線通過反應(yīng)混合液時(shí)，被其中IC吸收的光的強(qiáng)度D.測定光線通過反應(yīng)混合液時(shí)，透過的光的強(qiáng)度當(dāng)前第42頁\共有44頁\編于星期五\23點(diǎn)4.單向瓊脂擴(kuò)散法可用于A.抗體定性B.抗體定量C.抗原定性D.抗原定量5.雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，兩種受檢抗原的性質(zhì)完全相同時(shí)，沉淀線出現(xiàn)A.二條直線相交叉B.二條弧線完全融合C.二條弧線部分融合D.二條直線不連接6.火箭免疫電泳達(dá)到終點(diǎn)時(shí)應(yīng)A.火箭峰呈云霧狀B.火箭峰呈圓形C.火