第四章食品微生物學(xué)檢驗

食品安全（衛(wèi)生）標(biāo)準(zhǔn)食品安全法第18條——制定食品安全標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)當(dāng)以保障公眾身體健康為宗旨，做到科學(xué)合理、安全可靠食品安全標(biāo)準(zhǔn)是唯一強制性的標(biāo)準(zhǔn)食品安全標(biāo)準(zhǔn)由國務(wù)院衛(wèi)生行政部門負(fù)責(zé)制定公布當(dāng)前第1頁\共有70頁\編于星期六\9點食品安全標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容（一）食品中的致病性微生物、農(nóng)（獸）藥殘留、重金屬、污染物質(zhì)以及其他危害人體健康物質(zhì)的限量規(guī)定；（二）食品添加劑的品種、使用范圍、用量；（三）專供嬰幼兒的主輔食品的營養(yǎng)成分要求；（四）對與食品安全、營養(yǎng)有關(guān)的標(biāo)簽、標(biāo)識、說明書的要求；（五）食品生產(chǎn)經(jīng)營過程的衛(wèi)生要求；（六）與食品安全有關(guān)的質(zhì)量要求；（七）食品檢驗方法與規(guī)程；（八）其他需要制定為食品安全標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容；當(dāng)前第2頁\共有70頁\編于星期六\9點食品安全標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)指標(biāo)1.感官指標(biāo)2.理化指標(biāo)3.微生物指標(biāo)(1)菌落總數(shù)(2)大腸菌群(3)霉菌和酵母(4)致病菌(5)益生菌（乳酸菌、雙歧桿菌）(6)抗生素殘留、商業(yè)無菌當(dāng)前第3頁\共有70頁\編于星期六\9點如膨化食品中微生物學(xué)指標(biāo)項目指標(biāo)菌落總數(shù)/（CFU/g）

≤

100大腸菌群/（MPN/100g）≤90致病菌沙門氏菌志賀氏菌金黃色葡萄球菌

不得檢出當(dāng)前第4頁\共有70頁\編于星期六\9點食品安全檢驗方法與規(guī)程在食品安全標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的每個項目，為保證檢驗結(jié)果對評價食品衛(wèi)生質(zhì)量有可比性、準(zhǔn)確性、統(tǒng)一性和權(quán)威性，使之具有科學(xué)的評價意義，都必須規(guī)定統(tǒng)一的檢驗方法和條件。理化檢驗（GB/T5009）微生物檢驗（GB/T4789）放射性物質(zhì)檢驗（GB/Tl4883）食品安全性毒理學(xué)評價程序（GB/Tl5193）當(dāng)前第5頁\共有70頁\編于星期六\9點為什么要進(jìn)行食品微生物學(xué)檢驗食品安全問題是關(guān)系到人民健康、國家經(jīng)濟（特別是工業(yè)、貿(mào)易和農(nóng)業(yè)）的可持續(xù)發(fā)展和社會穩(wěn)定的重要問題，是世界關(guān)注的熱點問題食品微生物污染問題突出，細(xì)菌性、真菌性食物中毒占各種食物中毒之首，每年的發(fā)生數(shù)量、受害人數(shù)、死亡人數(shù)和造成的經(jīng)濟損失都是非常巨大的，我國如此，先進(jìn)的發(fā)達(dá)國家同樣深受其害當(dāng)前第6頁\共有70頁\編于星期六\9點為什么要進(jìn)行食品微生物學(xué)檢驗食品微生物學(xué)檢驗的廣泛應(yīng)用和不斷改進(jìn)，是制定各級預(yù)防、監(jiān)控和預(yù)警系統(tǒng)的重要組成部分，是食品微生物污染的溯源、控制和降低由此引起的一系列重大損失的重要有效手段，對促進(jìn)人民身體健康、經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展和社會穩(wěn)定都很重要，具有較大的經(jīng)濟、社會和衛(wèi)生意義。當(dāng)前第7頁\共有70頁\編于星期六\9點食品微生物檢驗的范圍食品不論在產(chǎn)地或加工前后，均可能遭受微生物的污染。污染的機會和原因很多，一般有：食品生產(chǎn)環(huán)境的污染，食品原料的污染，食品加工過程的污染等。當(dāng)前第8頁\共有70頁\編于星期六\9點根據(jù)食品被細(xì)菌污染的原因和途徑可知，食品微生物檢驗的范圍1、生產(chǎn)環(huán)境的檢驗：車間用水、空氣、地面、墻壁等。2、原輔料檢驗：包括食用動物、谷物、添加劑等一切原輔材料。3、食品加工、儲藏、銷售諸環(huán)節(jié)的檢驗：包括食品從業(yè)人員的衛(wèi)生狀況檢驗、加工工具、運輸車輛、包裝材料的檢驗等。4、食品的檢驗：重要的是對出廠食品、可疑食品及食物中毒食品的檢驗。當(dāng)前第9頁\共有70頁\編于星期六\9點微生物學(xué)檢驗方法國家標(biāo)準(zhǔn)的演變建國六十多年來，我國食品安全（衛(wèi)生）微生物學(xué)檢驗方法的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段。——方法逐步建立、統(tǒng)一階段（1949～1976年）——方法標(biāo)準(zhǔn)化形成階段（1977～1984年）——不斷修訂和完善階段（1985年至今）當(dāng)前第10頁\共有70頁\編于星期六\9點第一節(jié)GB/T4789.1－2010總則1范圍——規(guī)定了食品微生物檢驗基本原則和要求適用于食品微生物學(xué)檢驗2規(guī)范性引用文件3實驗室基本要求（環(huán)境、人員、設(shè)備、檢驗用品、培養(yǎng)基和試劑、菌株）4樣品的采集（原則、方案、方法、標(biāo)記、儲存和運輸）5樣品檢驗（處理、檢驗方法的選擇）6生物安全與質(zhì)量控制7記錄與報告8檢驗后處理（檢畢樣品處理、不進(jìn)行復(fù)檢）當(dāng)前第11頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第12頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第13頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第14頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第15頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第16頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第17頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第18頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第19頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第20頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第21頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第22頁\共有70頁\編于星期六\9點當(dāng)前第23頁\共有70頁\編于星期六\9點食品微生物學(xué)檢驗的一般程序檢驗前準(zhǔn)備樣品的采集與處理樣品的送檢與檢驗檢驗結(jié)果報告當(dāng)前第24頁\共有70頁\編于星期六\9點食品微生物學(xué)檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容細(xì)菌——菌落總數(shù)、大腸菌群、腸道致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌）霉菌——霉菌與酵母菌總數(shù)及產(chǎn)毒霉菌的鑒別等等當(dāng)前第25頁\共有70頁\編于星期六\9點第二節(jié)食品中菌落總數(shù)的測定

GB4789.2—2010一、實驗?zāi)康?.掌握菌落（細(xì)菌）總數(shù)測定程序和要點。2.學(xué)會對不同樣品稀釋度確定原則。當(dāng)前第26頁\共有70頁\編于星期六\9點二、概述菌落總數(shù)：食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1克或1毫升檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)

衛(wèi)生學(xué)意義：判定食品被細(xì)菌污染程度；觀察細(xì)菌在食品中繁殖動態(tài)。以便對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)當(dāng)前第27頁\共有70頁\編于星期六\9點三、實驗步驟檢樣

10倍稀釋

2-3個連續(xù)適宜稀釋度，各以1ml之量加入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)

每皿內(nèi)加入適量平板計數(shù)瓊脂，混勻

36±1℃培養(yǎng)48h

菌落計數(shù)、報告當(dāng)前第28頁\共有70頁\編于星期六\9點圖當(dāng)前第29頁\共有70頁\編于星期六\9點四、思考題為什么平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基在使用前要保持溫度在45℃左右？如何保持？在進(jìn)行菌落總數(shù)測定時，為什么培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？培養(yǎng)溫度為什么選擇36℃？根據(jù)菌落總數(shù)的原始記錄報告測定結(jié)果。說明在進(jìn)行菌落總數(shù)測定時應(yīng)特別注意的問題當(dāng)前第30頁\共有70頁\編于星期六\9點食品中大腸菌群的測定

GB4789.3—2010一、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)食品中大腸菌群的測定方法。2.了解大腸菌群檢驗的衛(wèi)生學(xué)意義當(dāng)前第31頁\共有70頁\編于星期六\9點二、概述概念：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

意義：食品被糞便污染的指標(biāo)菌；食品被致病菌污染的可能

當(dāng)前第32頁\共有70頁\編于星期六\9點三、（第一法MPN計數(shù)法）（1）檢樣稀釋（2）初發(fā)酵（LST）試驗--36±1℃培養(yǎng)48h（3）復(fù)發(fā)酵（BGLB）驗證--36±1℃培養(yǎng)48h（4）報告當(dāng)前第33頁\共有70頁\編于星期六\9點LST肉湯管或BGLB管是否產(chǎn)氣？當(dāng)前第34頁\共有70頁\編于星期六\9點LST肉湯管或BGLB管是否產(chǎn)氣？當(dāng)前第35頁\共有70頁\編于星期六\9點大腸菌群測定第二法——平板計數(shù)法當(dāng)前第36頁\共有70頁\編于星期六\9點四、思考題初發(fā)酵（LST）試驗后，產(chǎn)氣的管怎么做初發(fā)酵（LST）試驗后，沒有產(chǎn)氣的管能否報告為未檢出大腸菌群當(dāng)前第37頁\共有70頁\編于星期六\9點某學(xué)生在對糕點中大腸菌群檢驗時，實驗結(jié)果的原始記錄（采用稀釋度為1g，0.1g，0.01g）：發(fā)酵管編號：12345～9初發(fā)酵試驗：＋＋＋＋－復(fù)發(fā)酵試驗：＋＋－－根據(jù)上述試驗結(jié)果，查表，說明大腸菌群的最可能數(shù)。當(dāng)前第38頁\共有70頁\編于星期六\9點食品中沙門氏菌的檢驗沙門氏菌——最重要的病原菌屬，根據(jù)生化特性分為6個亞屬。檢查食品中沙門氏菌的衛(wèi)生學(xué)意義沙門氏菌可引起人類傷寒、副傷寒和食物中毒---在世界各地的食物中毒中常占首位或第二位當(dāng)前第39頁\共有70頁\編于星期六\9點沙門氏菌檢驗程序GB4789.4-2010為什么要前增菌？前增菌時間不能長？為什么要用2種增菌液？當(dāng)前第40頁\共有70頁\編于星期六\9點平板分離——為什么用2種選擇性鑒別培養(yǎng)基沙門氏菌在BS上的可疑菌落特征當(dāng)前第41頁\共有70頁\編于星期六\9點在HE培養(yǎng)基上的典型菌落當(dāng)前第42頁\共有70頁\編于星期六\9點沙門氏菌TSI的特征當(dāng)前第43頁\共有70頁\編于星期六\9點如何提高沙門氏菌的檢出率？對樣品進(jìn)行前增菌，使受損的沙門氏菌恢復(fù)活力選擇性增菌使用兩種選擇性分離增菌液，一種是抑制除沙門氏菌以外其它腸道菌的生長，一種是在不影響其他腸道菌生長的情況下促進(jìn)沙門氏菌的生長。為了最大可能的檢出沙門氏菌，原則上必須使用兩種以上選擇性分離培養(yǎng)基接TSI時，應(yīng)盡可能多挑幾個可疑菌落當(dāng)前第44頁\共有70頁\編于星期六\9點C-BSI-BS當(dāng)前第45頁\共有70頁\編于星期六\9點C-HEI-HE當(dāng)前第46頁\共有70頁\編于星期六\9點生化試驗在接種TSI瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時增加一項營養(yǎng)瓊脂（NA），經(jīng)TSI瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的選擇后，可篩掉大部分非沙門氏菌株，大大減少了工作量同時直接接種蛋白胨水(供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、KCN培養(yǎng)基的內(nèi)容。本部分還增加了對疑似菌落進(jìn)行留樣確認(rèn)的部分，以備必要時復(fù)查血清學(xué)鑒定（選擇做）——將含有已知抗體的診斷血清與待檢菌懸液各一滴要玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽性反應(yīng)。此法簡便快速，適用于新分得的細(xì)菌的鑒定或分型。當(dāng)前第47頁\共有70頁\編于星期六\9點報告綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結(jié)果,報告25g樣品中檢出或未檢出沙門氏菌當(dāng)前第48頁\共有70頁\編于星期六\9點食品中志賀氏菌的檢驗GB4789.5-2003志賀氏菌檢驗的衛(wèi)生學(xué)意義志賀氏菌檢驗的基本步驟：增菌、平板分離、生化試驗、血清學(xué)分型增菌——在對食品中志賀氏菌檢驗時，為什么要用志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素增菌并在厭氧環(huán)境41.5℃進(jìn)行培養(yǎng)？當(dāng)前第49頁\共有70頁\編于星期六\9點平板分離在對增菌液中可能存在的志賀氏菌進(jìn)行分離時，為什么要用選擇性強和選擇性弱的瓊脂平板各一個？志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)什么樣的菌落特征？為什么？當(dāng)前第50頁\共有70頁\編于星期六\9點志賀氏菌的菌落典型特征圖當(dāng)前第51頁\共有70頁\編于星期六\9點志賀氏菌的菌落典型特征圖當(dāng)前第52頁\共有70頁\編于星期六\9點福氏志賀氏菌形態(tài)圖當(dāng)前第53頁\共有70頁\編于星期六\9點鮑氏志賀氏菌形態(tài)圖當(dāng)前第54頁\共有70頁\編于星期六\9點志賀氏菌的TSI試驗可疑志賀氏菌非志賀氏菌當(dāng)前第55頁\共有70頁\編于星期六\9點如何利用實驗判定細(xì)菌是否具有動力動力陰性（無鞭毛）的細(xì)菌沿著接種線生長，因此生長線清晰動力陽性（有鞭毛）的細(xì)菌可擴散生長，因此生長線模糊，呈羽毛狀半固體培養(yǎng)基、穿刺、培養(yǎng)、觀察當(dāng)前第56頁\共有70頁\編于星期六\9點血清學(xué)試驗顆粒性抗原（細(xì)菌等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。當(dāng)前第57頁\共有70頁\編于星期六\9點食品中金黃色葡萄球菌的檢驗GB/T4789.10致病性金黃色葡萄球菌定性檢驗的原理（3個）為什么要用7.5%氯化鈉肉湯溶液增菌制備Baird-Parker平板或血平板的過程中注意的問題當(dāng)前第58頁\共有70頁\編于星期六\9點金黃色葡萄球菌

在BP平板上的菌落特征當(dāng)前第59頁\共有70頁\編于星期六\9點金黃色葡萄球菌

在血平板上的菌落特征當(dāng)前第60頁\共有70頁\編于星期六\9點在Baird-Parker平板上的菌落特征如何？為什么？鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)有哪些？為什么？金黃色葡萄球菌血漿凝固酶試驗預(yù)防金黃色葡萄球菌食物中毒的發(fā)生當(dāng)前第61頁\共有70頁\編于星期六\9點食品中霉菌和酵母菌檢驗食品中霉菌學(xué)檢驗的衛(wèi)生學(xué)意義對食品中霉菌學(xué)檢驗時應(yīng)注意的問題在培養(yǎng)后的平板上出現(xiàn)的粘稠狀的菌落，如何確定它是酵母菌而不是細(xì)菌

根據(jù)原始記錄報告檢測結(jié)果當(dāng)前第62頁\共有70頁\編于星期六\9點霉菌菌落當(dāng)前第63頁\共有70頁\編于星期六\9點GB/T4789.35－2008

食品中乳酸菌檢驗乳酸菌——一群通過發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。乳桿菌屬雙歧桿菌屬鏈球菌屬的嗜熱鏈球菌當(dāng)前第64頁\共有70頁\編于星期六\9點檢驗程序樣品25g（mL）+225mL滅菌生理鹽