醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究方法及其在中醫(yī)研究中的應(yīng)用

第五章細(xì)胞生物學(xué)研究方法及其在中醫(yī)研究中的應(yīng)用

一些基本的問題，請大家思考：1．人、動(dòng)物、細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象的異同？2．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中醫(yī)的利弊？有沒有有利的地方，優(yōu)越于人的？3．細(xì)胞可不可以用來研究中醫(yī)？似乎還不如動(dòng)物，連整體都沒有了，如何用藥、如何辨證、如何整體觀？有沒有有利的地方，優(yōu)越于動(dòng)物的？4．如何選擇細(xì)胞生物學(xué)來研究中醫(yī)？能不能舉一些例子？比如你們開展的探索性實(shí)驗(yàn)。通常中藥復(fù)方面臨的系列學(xué)術(shù)問題：1）有無作用；2）哪些組合、配伍、藥物有效；3）藥物的有效部位、成分、及其組合；4）被調(diào)控的組織、系統(tǒng)、器官；5）被調(diào)控的基因、基因組；6）整個(gè)調(diào)節(jié)鏈、網(wǎng)；7）如何提高療效……對此，細(xì)胞生物學(xué)能做什么？教材引言部分1．介紹細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究內(nèi)容廣泛，主要包括以下幾個(gè)方面：1）細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成。2）細(xì)胞及細(xì)胞器的功能。3）細(xì)胞的增殖與分化。4）細(xì)胞的衰老與死亡。2．若干定義細(xì)胞培養(yǎng)是指細(xì)胞的體外培養(yǎng)。具體地說，是在無菌條件下，把動(dòng)物或植物的細(xì)胞從有機(jī)體分離出來，置于培養(yǎng)器皿中，在一個(gè)合適的環(huán)境中給以營養(yǎng)物質(zhì)，使細(xì)胞能繼續(xù)生存和生長的一種方法。組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)，如果體外培養(yǎng)的是組織、器官或器官原基，則稱為組織培養(yǎng)或器官培養(yǎng)。3．細(xì)胞生物學(xué)的優(yōu)點(diǎn)（1）因素單純：培養(yǎng)細(xì)胞不受體內(nèi)各種復(fù)雜因素的影響。（2）實(shí)驗(yàn)條件易控：人為改變培養(yǎng)條件，即可觀察細(xì)胞在單因素或多因素影響下的生理改變。（3）重復(fù)性好：可避免種屬及個(gè)體之間的差異。（4）方法簡便：便于使用各種技術(shù)方法觀察研究活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)。（5）經(jīng)濟(jì)、快速：節(jié)約動(dòng)物及藥物，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得較多的實(shí)驗(yàn)樣品和研究結(jié)果。（6）便于應(yīng)用人體組織。（7）結(jié)果易于分析。以上（5）實(shí)質(zhì)是兩個(gè)部分：經(jīng)濟(jì)（實(shí)驗(yàn)成本低）：節(jié)約動(dòng)物、藥物；快速（實(shí)驗(yàn)周期較短）：可在較短時(shí)間內(nèi)獲得較多的實(shí)驗(yàn)樣品和研究結(jié)果。比較：離體和在體研究的利弊。解釋“離體”和“在體”。那么“在體”的優(yōu)點(diǎn)有沒有，是什么？實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)1）保持了機(jī)體的完整性，神經(jīng)、體液、臟腑、組織、藥物代謝，等。2）符合臨床用藥。3）取材不受限制，創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)不受限制（不傷害人，或人不可以的實(shí)驗(yàn)）。4）數(shù)量滿足方便。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物其他優(yōu)點(diǎn)與細(xì)胞培養(yǎng)類似，即相對于人而言：5）實(shí)驗(yàn)條件易控：人為改變培養(yǎng)條件，即可觀察細(xì)胞在單因素或多因素影響下的生理改變。6）重復(fù)性好：可避免種屬及個(gè)體之間的差異（純系動(dòng)物）。7）方法簡便：便于使用各種技術(shù)方法觀察研究活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)。8）結(jié)果易于分析。9）經(jīng)濟(jì)：節(jié)約藥物和其他費(fèi)用。10）實(shí)驗(yàn)周期較短。4．細(xì)胞生物學(xué)的用途（1）觀測不同組織細(xì)胞的生物特性及其中醫(yī)藥調(diào)整作用。（2）觀測不同腫瘤細(xì)胞，了解中醫(yī)藥對生物學(xué)特征，包括轉(zhuǎn)移、分化、凋亡等影響。（3）細(xì)胞系，目的同上，而細(xì)胞穩(wěn)定，而以上原代細(xì)胞的部分生物特性，可能會(huì)逐漸消失。（4）工具，主要為細(xì)胞系，作為一種載體使用。比如研究基因的表達(dá)與調(diào)控，經(jīng)常使用報(bào)道基因技術(shù)、哺乳類載體技術(shù)、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，等（簡單介紹）。第一節(jié)細(xì)胞生物學(xué)研究的主要技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要包括：細(xì)胞體外培養(yǎng)的一般條件、細(xì)胞培養(yǎng)的基本步驟、培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察。（一）細(xì)胞體外培養(yǎng)的一般條件1．培養(yǎng)基細(xì)胞需要生長在具有充分營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有的成分：（1）含氮化合物：是蛋白質(zhì)和核酸的基本構(gòu)筑材料，動(dòng)物細(xì)胞至少需要12-13種氨基酸。（2）維生素和某些金屬離子：可維持酶的正常功能，一般需要八種水溶性維生素和鐵、銅、鋅等金屬離子。（3）無機(jī)鹽離子：調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度和滲透壓、維持酸堿度。（4）碳水化合物：是體外細(xì)胞的主要能源，動(dòng)物細(xì)胞通常利用葡萄糖等單糖物質(zhì)。（5）促生長因子：激素、生長因子等可促進(jìn)細(xì)胞增殖生長，維持某些細(xì)胞的特殊功能。（6）血清：大多數(shù)培養(yǎng)液中需加入血清，常用經(jīng)56℃、30min滅活的胎牛血清、小牛血清，血清中含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子以及其它活性物質(zhì)。培養(yǎng)液中血清的含量一般為10-20%，才可維持細(xì)胞的正常生長。

2．培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞一般接種于盛有pH7.2-7.4的培養(yǎng)液的器皿中，放置在36-37℃、5%CO2加95%空氣混合氣體、95-100%濕度的培養(yǎng)箱中。這種環(huán)境適合多種細(xì)菌、支原體、真菌的生長。因此，在培養(yǎng)液中應(yīng)加入適量的抗生素（如青霉素、鏈霉素），并在細(xì)胞培養(yǎng)的全過程保持無菌操作。（二）細(xì)胞培養(yǎng)的基本步驟體外培養(yǎng)的細(xì)胞可分為原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞：1．定義（1）原代細(xì)胞：是指從機(jī)體取出后直接培養(yǎng)的細(xì)胞。（2）傳代細(xì)胞：是指適合在體外培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞。（3）細(xì)胞系：原代細(xì)胞一旦傳代培養(yǎng)即稱為細(xì)胞系。（4）細(xì)胞株：若細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)，由單細(xì)胞增殖形成細(xì)胞群，則稱為細(xì)胞株。2．細(xì)胞體外培養(yǎng)的一些基本理論和知識（1）細(xì)胞周期（增殖態(tài)）G1+S+G2+MG1：細(xì)胞分裂后期，DNA合成前。S：DNA合成期，DNA增加一倍（拷貝）G2：介于S與M之間，時(shí)間短。M：細(xì)胞有絲分裂期。（2）不同的稱謂和意義名稱原代培養(yǎng)細(xì)胞系階段首次轉(zhuǎn)化（指數(shù)生長期）連續(xù)細(xì)胞系（不死）有限細(xì)胞系（死亡）時(shí)間0~2周2~12周12周以上*50代，大約25~50周（6~12月）。原代細(xì)胞培養(yǎng)步驟一般如下：從動(dòng)物或人體取出組織塊，剪碎，用濃度與活性適中的胰蛋白酶或膠原酶與乙二胺四乙酸（EDTA）等將細(xì)胞消化分散（不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)），細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于培養(yǎng)器皿內(nèi)，給予合適的培養(yǎng)液及其它培養(yǎng)條件，進(jìn)行靜置或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。大鼠超排卵卵巢組織形態(tài)與正常組織

卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)1-PMSG刺激后的大鼠雙側(cè)卵巢；2-正常大鼠雙側(cè)卵巢?！远宕T士畢業(yè)論文

超凈工作臺原理及其使用：常見的問題：污染。主要原因：操作不當(dāng)。其余如實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、超凈臺污染和過濾材料陳舊、試劑污染、材料污染。H22細(xì)胞培養(yǎng)污染污染常見原因的分析（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長與觀察不同來源的細(xì)胞在體外的生長方式不同，根據(jù)是否貼附于支持物上生長，可分為貼附型與懸浮型。細(xì)胞貼壁：貼附型細(xì)胞而言，剛接種入培養(yǎng)液的細(xì)胞多呈圓球形，幾十分鐘至數(shù)小時(shí)后，細(xì)胞即貼附在瓶壁上，此稱為細(xì)胞貼壁。細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展呈多形態(tài)，經(jīng)過一段潛伏期后細(xì)胞即開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般在數(shù)天內(nèi)就鋪滿瓶壁，形成致密的細(xì)胞單層。對數(shù)生長期是細(xì)胞一代中活力最好的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的、最主要的階段。垂體細(xì)胞前葉細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)垂體細(xì)胞前葉細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)

肝癌QGY-7703細(xì)胞40×肺癌細(xì)胞傳代后貼壁不好200×細(xì)胞培養(yǎng)中的一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象是細(xì)胞的接觸抑制，當(dāng)貼壁生長的細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，就停止分裂增殖，相互緊密接觸的細(xì)胞不再進(jìn)入S期。肝癌QGY-7703細(xì)胞400×肺癌細(xì)胞100×肝癌細(xì)胞有接觸抑制現(xiàn)象。肺癌細(xì)胞則沒有接觸抑制現(xiàn)象。細(xì)胞傳代：長成單層的細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間，一定要重新分散后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，使其繼續(xù)分裂增殖，否則就要衰退死亡，不能維持其生命活動(dòng)。這一分瓶再重新培養(yǎng)的過程，稱作細(xì)胞的傳代。傳代后的細(xì)胞在新的培養(yǎng)瓶中約經(jīng)6-24h開始貼壁，再次進(jìn)入新的生長周期。細(xì)胞系在體外的可傳代數(shù)與細(xì)胞種類及原供體的年齡等有關(guān)。人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳30-50代，相當(dāng)于150-300個(gè)細(xì)胞增殖周期，能維持一年左右的生存時(shí)間，最后衰老凋亡（Apoptosis）；肝細(xì)胞及腎細(xì)胞僅能傳幾代或十幾代，而神經(jīng)元一般不能傳代。已建立的細(xì)胞系種類很多，如Hela、3T3、BHK-21、CHO等。體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)，與體內(nèi)原有細(xì)胞不同，按形態(tài)大致可分為成纖維型細(xì)胞、上皮型細(xì)胞、游走型細(xì)胞、多形型細(xì)胞。傳代細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，可以用液氮冷凍的方式加以保存。一旦實(shí)驗(yàn)需要，可以復(fù)蘇后再繼續(xù)培養(yǎng)。二、形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)包括各種光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用。肝癌QGY-7703細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)肝癌SMMC7721細(xì)胞正常大鼠血清肝癌SMMC7721細(xì)胞清熱解毒血清肝癌SMMC7721細(xì)胞5-FU血清肝癌SMMC7721細(xì)胞活血化瘀血清——引自許海達(dá)碩士學(xué)位論文三、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的任務(wù)：細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的任務(wù)是研究細(xì)胞內(nèi)各種成分的含量及分布情況以及這些成分在細(xì)胞活動(dòng)過程中的動(dòng)態(tài)變化，以闡明細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及細(xì)胞的各種生理和病理現(xiàn)象。（一）酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)細(xì)胞中有很多酶，它們的分布不是雜亂的，在細(xì)胞內(nèi)都有特定的位置，這種酶存在的特定部位稱為酶的定位。早期的細(xì)胞化學(xué)工作主要在光學(xué)顯微鏡水平上進(jìn)行，又稱為組織化學(xué)。近年來，這一技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中已受到越來越多的重視。首先，酶的細(xì)胞化學(xué)定位對研究細(xì)胞的生理功能和病理過程有重要意義；其次，很多酶可以作為細(xì)胞膜和各種細(xì)胞器的標(biāo)記酶，而且有些細(xì)胞還有其特有的標(biāo)記酶，這就為研究細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)胞器的相互關(guān)系以及細(xì)胞的鑒別等提供了新的手段。（二）免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是利用免疫反應(yīng)定位組織或細(xì)胞中抗原成分分布的一類技術(shù)。早期的免疫細(xì)胞化學(xué)工作是在光學(xué)顯微鏡水平上進(jìn)行的，又稱免疫組織化學(xué)。目前，光鏡和電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)和病理學(xué)等方面的應(yīng)用已相當(dāng)普遍。（三）放射自顯影技術(shù)放射自顯影是利用放射性核素所放射出來的射線作用于感光材料的鹵化銀晶體，從而產(chǎn)生潛影，并通過顯影過程把“像”顯示出來，以研究用放射性核素標(biāo)記的物質(zhì)在生物體內(nèi)的定位和定量的一種技術(shù)。四、細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的離心分離技術(shù)在顯微和超微結(jié)構(gòu)水平上的形態(tài)觀察和細(xì)胞化學(xué)方法為了解細(xì)胞和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能提供了不少資料，但是，要深入了解細(xì)胞和細(xì)胞器的功能活動(dòng)，還必須分離各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分，研究它們的化學(xué)組成、酶活性和代謝特點(diǎn)。五、分析細(xì)胞學(xué)技術(shù)（一）流式細(xì)胞計(jì)（FCM）

FCM（flowcytometer），又稱熒光激活細(xì)胞分類儀（Fluorescenceactivatedcellsortor，F(xiàn)ACS），流體噴射+激光+空氣計(jì)數(shù)+γ射線能譜術(shù)+計(jì)算機(jī)+顯微熒光光度計(jì)。方法：細(xì)胞分離、固定、染色、通過、檢測、分析。可以分析單細(xì)胞和群體細(xì)胞。速度：5000個(gè)細(xì)胞/秒！FCM可用于測量細(xì)胞的多種參數(shù)，其中有些細(xì)胞參數(shù)不經(jīng)染色處理就能直接測量，如細(xì)胞大小、形狀、胞漿顆粒、色素含量、蛋白熒光及氧化還原狀態(tài)等；一些參數(shù)必須經(jīng)染色（熒光標(biāo)記）后才能測量，如DNA含量與堿基比、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、RNA含量、總蛋白、堿性蛋白、巰基、表面抗原、細(xì)胞骨架組成、膜完整性與通透性、酶活性、內(nèi)吞作用、表面電荷、細(xì)胞內(nèi)受體、DNA合成、凋亡、膜流動(dòng)性與微粘度、表面受體、胞漿與線粒體膜電位、膜結(jié)合Ca++、胞漿Ca++、細(xì)胞內(nèi)pH等。流式免疫熒光技術(shù)進(jìn)行免疫細(xì)胞標(biāo)記：以明確淋巴瘤的起源細(xì)胞類型。Thy1（CD3抗體）：T細(xì)胞特異性抗體B220（CD45R）：B細(xì)胞特異性抗體J：wild-tpye淋巴結(jié)K：Mus81+/-T系淋巴瘤L：Mus81+/-B系淋巴瘤流式細(xì)胞計(jì)數(shù)（二）顯微分光光度計(jì)（MSP）MSP（microspectrophotometer，細(xì)胞光度計(jì)），光學(xué)顯微鏡+熒光顯微鏡+分光光度計(jì)。對細(xì)胞內(nèi)的某些重要的生物分子（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）的含量進(jìn)行定量測試。（三）圖像分析系統(tǒng)（IAS）IAS是分析細(xì)胞學(xué)中的主要測量手段之一，常用于細(xì)胞形態(tài)分析、白細(xì)胞和紅細(xì)胞分類、腫瘤細(xì)胞分析、染色體核型分類、微血管系統(tǒng)分析等方面。（四）激光共聚焦儀（interactivelasercytometer）建立于顯微分光光度計(jì)與流式細(xì)胞計(jì)基礎(chǔ)之上，研究單細(xì)胞水平的結(jié)構(gòu)、功能、應(yīng)答反應(yīng)。第二節(jié)細(xì)胞生物學(xué)在中醫(yī)藥研究中的現(xiàn)狀細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用，現(xiàn)有文獻(xiàn)主要涉及藥用植物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)，有效中藥的篩選，中藥藥理及毒理研究等方面。一、藥用植物與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞生物學(xué)在中藥藥理研究中的應(yīng)用中藥及復(fù)方的細(xì)胞藥理學(xué)給藥方式主要有兩種。其一，將中藥及復(fù)方的粗制劑直接加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中。由于粗制劑存在不少雜質(zhì)成分，它們未經(jīng)過腸道選擇性吸收及體內(nèi)的代謝過程，從而影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

其二，血清藥理學(xué)給藥。1984年日本學(xué)者提出了給動(dòng)物灌服中藥一定時(shí)間后采血，分離血清，用此含藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，1988年命名此新的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法為中藥“血清藥理學(xué)”。近年來國內(nèi)外應(yīng)用血清藥理學(xué)方法研究中藥及復(fù)方積累了一定的經(jīng)驗(yàn)。從目前已有的工作來看，中藥血清藥理學(xué)方法可能具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1）中藥粗制劑經(jīng)口服吸收后，用含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，可排除中藥粗制劑中雜質(zhì)成分、各種電解質(zhì)或鞣質(zhì)成分、不同酸堿度等各種干擾因素的影響，比較接近藥物體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過程。

2）對體外實(shí)驗(yàn)有效的中藥復(fù)方，如果其有效成分不能從胃腸道吸收或經(jīng)體內(nèi)吸收代謝后失活，則血清藥理學(xué)方法可避免體外實(shí)驗(yàn)得出的錯(cuò)誤結(jié)論。

3）對某些本身無直接作用，但經(jīng)體內(nèi)代謝后產(chǎn)生作用的藥物，血清藥理學(xué)可分辨出來。如何應(yīng)用？以二仙湯研究為例。

——引自董冰峰碩士論文背景介紹：1．二仙湯的由來和構(gòu)成。2．治療更年期綜合征的國內(nèi)外現(xiàn)狀。3．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證和機(jī)理研究。問題：1．作用部位，直接的還是間接的？2．有效組分，拆方、單味中藥、有效成分？3．血清藥理學(xué)與直接給藥的異同？

1．二仙湯及其拆方對大鼠垂體細(xì)胞LH表達(dá)的作用（1）二仙湯及拆中，滋陰（ZY）組含藥血清有顯著的促進(jìn)作用。（2）二仙湯全方及滋陰、當(dāng)歸直接給藥，均能明顯促進(jìn)垂體前葉細(xì)胞LH水平的提高。溫腎組有一定升高的趨勢。

二仙湯及拆方血清對垂體LH表達(dá)的作用

二仙湯及拆方直接給藥對垂體LH表達(dá)的作用NS-正常大鼠血清對照，Control-空白對照；QF-全方，WS-溫腎，ZY-滋陰，DG-當(dāng)歸以上的差別說明什么問題？

1）給藥方式差異及可能的機(jī)理。

2）實(shí)驗(yàn)要求重復(fù)。

3）篩選成分及成分組合的增加。（3）淫羊藿苷和仙茅苷兩種有效成分與DMSO溶劑組比較，均有提高培養(yǎng)液中LH水平的趨勢。中藥有效成分對垂體前葉細(xì)胞分泌LH的作用Control對照；DMSO對照；YYH-DMSO+淫羊藿苷；XM-DMSO+仙茅苷

2．二仙湯及其拆方對大鼠垂體FSH表達(dá)的作用（1）二仙湯及拆方藥物血清對垂體細(xì)胞FSH表達(dá)均有一定的降低趨勢。二仙湯全方及拆方血清對垂體前葉細(xì)胞FSH的作用NS-正常大鼠血清對照組，QF-全方，WS-溫腎，ZY-滋陰，DG-當(dāng)歸（2）二仙湯及拆方直接給藥可以明顯增強(qiáng)垂體前葉細(xì)胞FSH的水平（P<0.01）。溫腎組濃度低作用反而增強(qiáng)；全方濃度低，作用弱（P<0.01）；而滋陰方濃度變化區(qū)別不明顯。二仙湯及拆方直接給藥對垂體細(xì)胞FSH表達(dá)的作用Control-空白對照；QF1-10-3全方；QF2-1/6×10-3全方；WS1-10-3溫腎；WS2-1/3×10-3溫腎；ZY1-10-3滋陰；ZY2-1/2×10-3滋陰；DG-10-3當(dāng)歸（3）仙茅苷和淫羊藿苷直接加入對FSH表達(dá)的作用結(jié)果：DMSO對垂體前葉細(xì)胞FSH水平有明顯促進(jìn)作用（與Control組比較，P<0.05）。而中藥有效成分則對DMSO這一作用有對抗作用，其中淫羊藿苷組與DMSO溶劑對照組比較顯著性降低（P<0.05）。二仙湯有效成分對垂體前葉細(xì)胞FSH水平的作用Control-對照；DMSO-對照；XM-DMSO+仙茅苷；YYH-DMSO+淫羊藿苷

3．二仙湯及拆方對垂體前葉細(xì)胞LH、FSH轉(zhuǎn)錄的作用二仙湯及其各拆方直接給藥能促進(jìn)LHmRNA、FSHmRNA轉(zhuǎn)錄，且以全方組作用最強(qiáng)，其中對LHmRNA轉(zhuǎn)錄的作用，滋陰組作用明顯強(qiáng)于溫腎組。RT-PCR凝膠電泳示意圖DNAmarker，大鼠β-actin，大鼠LH和FSH。（1）無血清Control組；（2）仙茅苷；（3）DMSO結(jié)果：（1）促進(jìn)LH轉(zhuǎn)錄水平：二仙湯、滋陰方大劑量優(yōu)于小劑量；溫腎方小劑量弱，大劑量更弱。（2）促進(jìn)FSH轉(zhuǎn)錄水平：二仙湯大劑量優(yōu)于小劑量；溫腎方、滋陰方大、小劑量區(qū)別不大，當(dāng)歸組無明顯作用。二仙湯全方及拆方對垂體前葉細(xì)胞兩種激素mRNA水平的作用Control-空白對照；QF1-1/6×10-3全方；QF2-10-3全方；WS1-1/3×10-3溫腎；WS2-10-3溫腎；ZY1-1/2×10-3滋陰；ZY2-10-3滋陰；DG-10-3當(dāng)歸

4．淫羊藿苷、仙茅苷對垂體細(xì)胞LH、FSH轉(zhuǎn)錄作用結(jié)果：（1）LH：DMSO有一定下調(diào)趨勢。仙茅苷有下降趨勢，淫羊藿苷明顯升高。（2）FSH：DMSO有較明顯的下調(diào)趨勢。仙茅苷有下降趨勢，淫羊藿苷明顯升高。二仙湯有效成分對垂體前葉細(xì)胞兩種激素mRNA水平的作用Control-空白對照，DMSO對照，XM-DMSO+仙茅苷；YYH-DMSO+淫羊藿苷

5．二仙湯藥物血清對卵泡顆粒細(xì)胞E2的作用（1）大鼠血清與二仙湯血清有促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞合成和分泌E2的作用。二仙湯藥物血清對卵泡顆粒細(xì)胞合成和分泌E2的作用（2）二仙湯及拆方不同濃度直接給藥對顆粒細(xì)胞E2的作用結(jié)果：溫腎組大劑量好，有顯著性差異。二仙湯全方及拆方不同濃度直接加入對顆粒細(xì)胞E2水平的作用（3）溫腎方、滋陰方直接給藥量效觀察結(jié)果：溫腎方促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞E2分泌，有量效關(guān)系；滋陰方作用相反。溫腎方、滋陰方直接給藥量效觀察（4）各單味藥直接給藥對卵泡顆粒細(xì)胞E2的作用結(jié)果：仙茅、當(dāng)歸、巴戟