藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析詳解演示文稿

藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析詳解演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)（優(yōu)選）藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析當(dāng)前第2頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)抗體藥物銷(xiāo)售趨勢(shì)圖當(dāng)前第3頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)國(guó)際抗體藥物2009年美國(guó)市場(chǎng)上的抗體藥物成為生物技術(shù)藥物銷(xiāo)售額最大的類(lèi)別。2010年美國(guó)市場(chǎng)的單抗藥物銷(xiāo)售額為185億美元2011年，全球單抗藥物的市場(chǎng)總量已經(jīng)達(dá)到628億美元，世界范圍內(nèi)的單抗藥物銷(xiāo)份額約是整個(gè)生物制藥市場(chǎng)份額的36%。當(dāng)前第4頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)國(guó)內(nèi)抗體藥物目前我國(guó)的上市抗體品種中,國(guó)外進(jìn)口單抗占據(jù)多數(shù)2011年國(guó)內(nèi)市場(chǎng)規(guī)模超過(guò)10億元我國(guó)抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的主要限制因素：動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已成為各個(gè)國(guó)家生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化的核心競(jìng)爭(zhēng)點(diǎn)抗體下游純化成本已占45%到70%高質(zhì)量純化工藝研究刻不容緩QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）理念的應(yīng)用當(dāng)前第5頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)抗體偶聯(lián)藥物(AntibodyDrugConjugates，ADC)結(jié)合單克隆抗體的靶

向性和小分子藥物的

高度細(xì)胞毒性，可以

有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，

在臨床前研究、甚至人體臨床研究中，取得了良好的抗腫瘤效果，成為生物藥物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一;ADC藥物為疾病的“精準(zhǔn)醫(yī)療”提供有效的武器?？贵w-藥物偶聯(lián)劑（ADCs）的研究進(jìn)展與產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀當(dāng)前第6頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)Antibodyandstructure特點(diǎn)：2個(gè)基因決定一個(gè)蛋白質(zhì)與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，高度專(zhuān)一性當(dāng)前第7頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)抗原和抗原決定簇一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定簇每個(gè)抗原決定簇至少誘生一種專(zhuān)一性抗體蛋白質(zhì)抗原的決定簇含有六個(gè)以上氨基酸當(dāng)前第8頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)

。

當(dāng)前第9頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)克隆選擇

學(xué)說(shuō)當(dāng)前第10頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)單抗和多抗多克隆抗體（polyclonalantibody）指由不同B細(xì)胞產(chǎn)生的針對(duì)多種抗原決定簇的多種抗體混合物，如免疫血清。單克隆抗體（monoclonalantibody）指由一種

B細(xì)胞生產(chǎn)，針對(duì)某一抗原決定簇的單一抗體。當(dāng)前第11頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)Preparationofpolyclonalantibodies傳統(tǒng)抗血清抗原免疫混合抗體123412341234免疫前要先把抗原作成乳劑約在兩月內(nèi)注射五到八次當(dāng)前第12頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)Preparationofmonoclonalantibodies當(dāng)前第13頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)Preparationofrecombinantantibodies淋巴細(xì)胞總RNA抗體輕、重鏈文庫(kù)重組單鏈抗體基因輕、重單鏈基因大腸桿菌表達(dá)體系單鏈抗體當(dāng)前第14頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)單鏈抗體在重鏈與輕鏈之間加上一段連接肽，連成一條單鏈如果僅是兩條鏈的可變區(qū)，稱(chēng)為ScFv連接肽的長(zhǎng)度在10-15個(gè)氨基酸左右，不宜太長(zhǎng)或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是GGGGS×3當(dāng)前第15頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)Abasantigen-PrimaryandsecondaryantibodyPrimaryAbSecondaryAbPrimaryAbProteinA二抗針對(duì)一抗的物種特異性ProteinA針對(duì)所有動(dòng)物抗體Fc當(dāng)前第16頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)ImmunoassaysThemostimportantbiologicalassaysfor:Identificationofproteinsandsmallbio-moleculesQuantificationforcomplexbiologicalsamplewithoutseparationPowerfulseparationHighsensitivity,specificityandaccuracy

當(dāng)前第17頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)抗體的標(biāo)記方法放射性同位素標(biāo)記酶標(biāo)記熒光標(biāo)記有機(jī)分子熒光標(biāo)記綠色熒光蛋白標(biāo)記稀土熒光標(biāo)記通用標(biāo)記當(dāng)前第18頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)放射性碘標(biāo)記當(dāng)前第19頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)HRP酶標(biāo)記簡(jiǎn)單化學(xué)偶聯(lián)方法：

1．過(guò)碘酸鈉法：

僅用于HRP的標(biāo)記。HRP是一種糖蛋白，過(guò)碘酸鈉可將與酶活性無(wú)關(guān)的多糖羥基氧化為醛基，再與抗體蛋白的游離氨基結(jié)合，結(jié)合反應(yīng)后，再加人硼氫化鈉(NaHB4)還原后，形成穩(wěn)定的HRP—CH2—NH—IgG酶標(biāo)記物。為防止酶蛋白氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián)，常在標(biāo)記前知用二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白上的α和ε氨基。

2．戊二醛交聯(lián)標(biāo)記法：

戊二醛具有兩個(gè)活性醛基，分別與酶分子和抗體分子上的氨基結(jié)合。NaHB4HRP當(dāng)前第20頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)LabelingwithisoFITC當(dāng)前第21頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)GFPlabelingGFPgeneScFvgeneVectorexpressionGFPgeneProteinAgeneVectorexpressionAb-Fc當(dāng)前第22頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)通用標(biāo)記+Avidin/streptA+Anti-digoxinAb2ndAbProteinAPrimaryAbPrimaryAb當(dāng)前第23頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)ImportantassaysImmunostainingWesternblotFluorescentmicroscopyQuantificationofimmunostainingQuantitativeassays:Radioimmunoassay,RIA—competentbindingFluorescenceimmunoassay,FIAFPIA---homogeneousassayTRFIAEnzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA當(dāng)前第24頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)ImmunostainingFluorescence/luminescenceColorizationor當(dāng)前第25頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞單層細(xì)胞/組織固定免疫染色（熒光）顯微鏡觀(guān)察當(dāng)前第26頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記的c-Mycphalloidin熒光標(biāo)記的微絲熒光染色的細(xì)胞核合成圖像當(dāng)前第27頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)Immunoblot---WesternBlot當(dāng)前第28頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)ElectroblottinggelPVDFmembrane當(dāng)前第29頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)Immunostaining封閉分析抗體顯色抗體顯色數(shù)字化灰度圖像分析當(dāng)前第30頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)0.51246812162430(h)c-mycp53CyclinD1Actin當(dāng)前第31頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)CaNCaM:La3+HRPStreptAvidinBiotin當(dāng)前第32頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)RIAAssay當(dāng)前第33頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)免疫競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析---小分子抗原分析的基本方法Ag+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag[*AgAb:Precipitant↓]放射性計(jì)數(shù)當(dāng)前第34頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)常用分離沉淀技術(shù)鹽析法：飽和硫酸銨、硫酸鈉聚乙二醇法（w=6000）特點(diǎn)：快速，價(jià)廉，來(lái)源方便，受環(huán)境影響大抗體免疫沉淀法特點(diǎn)：分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價(jià)高，但成本高固相吸附劑當(dāng)前第35頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)RIA測(cè)量步驟恒量的*Ag、Ab加入反應(yīng)管中加入待測(cè)樣品、或標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度）37℃或4℃溫育加入分離劑分離結(jié)合及游離部分測(cè)定以總放射性為分母，測(cè)定*AgAb為分子，計(jì)算結(jié)合%，以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，濃度為坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)待測(cè)樣品的結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出濃度當(dāng)前第36頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)當(dāng)前第37頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)Calibrationcurve當(dāng)前第38頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay）當(dāng)前第39頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)SandwichELISA競(jìng)爭(zhēng)法（略）當(dāng)前第40頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)HighConvenienceHighSensitivity當(dāng)前第41頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)96-wellplate包被封閉結(jié)合顯色酶標(biāo)儀測(cè)定hv洗滌洗滌洗滌終止當(dāng)前第42頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)酶的底物

鄰苯二胺(OPD)+H2O2

TMBABTSHRP的底物氧化產(chǎn)物(橙紅色)492nm吸收2mol/L硫酸終止反應(yīng)AP的底物硝基苯磷酸酯對(duì)硝基酚(黃色)NaOH終止反應(yīng)

405nm吸收峰磷酸4-甲基傘酮（熒光底物）當(dāng)前第43頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)熒光偏振免疫分析當(dāng)前第44頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)PrincipleoffluorescencepolarizationemittingdipoleabsorbingdipoleexcitationlightpolarizedalongzxzyIIdetector當(dāng)前第45頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)FluorescencepolarizationimmunoassayAg+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag

HighpolarizedfluorescenceLowpolarizedfluorescence當(dāng)前第46頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)偏振度r當(dāng)前第47頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)時(shí)間分辨熒光免疫分析當(dāng)前第48頁(yè)\共有54頁(yè)\編于星期四\12點(diǎn)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000細(xì)胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5T