課題分解纖維素的微生物的分離

課題分解纖維素的微生物的分離第一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。纖維素能被土壤中某些微生物分解利用，這是因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生纖維素酶。課題背景草食性動物是怎樣消化食物中纖維素的？第三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一纖維素的分解需要在纖維素酶的催化作用下完成?；A(chǔ)知識（一）纖維素與纖維素酶第四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一

纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶第五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一①取二支20mL的試管實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml甲乙④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失

討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？第六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一

在一支試管中添加纖維素酶，另一支試管不添加纖維素酶；盡管醋酸－醋酸鈉緩沖液用量不同，但都能維持相同的pH。實(shí)驗(yàn)分析：該小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對照的？第七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一下列生物能分解纖維素的是（）①人②兔③牛④蘑菇⑤纖維桿菌A.①②③④⑤B.②③⑤C.②③④⑤D.③⑤C第八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一（二）纖維素分解菌的篩選1、篩選纖維素分解菌的方法是__________________________________

該方法可以通過________反應(yīng)直接篩選。剛果紅（CongoRed）染色法顏色第九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一2、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成____________，當(dāng)纖維素被_________分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以_____________為中心的________，我們可以通過____________來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素分解菌

透明圈是否產(chǎn)生透明圈第十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一第十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一練一練：1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是A.纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B.纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C.纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁D.葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖第十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是A.剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物B.剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物C.剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D.若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩

選出了纖維素分解菌第十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(三)第十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一①分布環(huán)境1、土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境中操作步驟

生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。②原因第十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一③實(shí)例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。④討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。第十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一2、選擇培養(yǎng)

增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。

①目的：②制備選擇培養(yǎng)基：③操作：

將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。第十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基組成提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、無機(jī)鹽KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g無機(jī)鹽酵母膏0.5g生長因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮源、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水第十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或者將纖維素改為葡萄糖。A、以上配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？

是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。C、你能否設(shè)計(jì)一個對照實(shí)驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基的作用第十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一

說明：分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。第二十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一

在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？第二十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一比較項(xiàng)目分解尿素的細(xì)菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基原理培養(yǎng)基類型目的鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法將細(xì)菌涂布在只有尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上將細(xì)菌涂布在只有纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株選擇培養(yǎng)第二十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一思考：本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？

本實(shí)驗(yàn)流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。第二十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101～107倍。3.梯度稀釋101102103104105106第二十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（1）制備鑒別培養(yǎng)基:（2）涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。第二十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長因子KH2PO40.25g無機(jī)鹽土豆汁100mL碳源、生長因子瓊脂15g凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉)第二十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一

挑選產(chǎn)生明顯透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。5、挑選產(chǎn)生透明圈的菌落第二十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一剛果紅染色法方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)

在長出茵落的培養(yǎng)基上，覆蓋質(zhì)量濃度為1mg／mL的CR溶液，10～15min后倒去CR溶液，加入物質(zhì)的量濃度為lmol／L的NaCI溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此時，產(chǎn)生纖維素酶的茵落周圍將會出現(xiàn)透明圈。第二十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一方法一中NaCl溶液的作用？思考：

漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強(qiáng)！第二十九頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一方法二：在倒平板時就加入剛果紅

配制質(zhì)量濃度為10mg／mI的CR溶液，滅菌后，按照每200mI培養(yǎng)基加入1mI的比例加入CR溶液，混勻后倒平板，等培養(yǎng)基上長出茵落后，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍將會出現(xiàn)明顯的透明圈。

第三十頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？染色法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)方法一方法二顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜操作簡便不存在菌落混雜問題1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。第三十一頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一比較項(xiàng)目分解尿素的細(xì)菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)原理培養(yǎng)基類型目的鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果pH升高指示劑會變紅剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法剛果紅染色法第三十二頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一

在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。6、純化培養(yǎng)第三十三頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一

1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。

2.分離的結(jié)果是否一致

由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。（四）結(jié)果分析與評價第三十四頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一

為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行_____________實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的發(fā)酵方法有______發(fā)酵和______發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的________含量進(jìn)行定量測定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

液體

固體

葡萄糖

（五）課題延伸第三十五頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一分解纖維素的微生物的分離纖維素酶種類、作用、催化活力剛果紅染色篩選原理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤取樣選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)純化培養(yǎng)前置染色法后置染色法富含纖維素土壤增大分解菌含量染色鑒別分離出分解菌課堂總結(jié)第三十六頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一D1、下列材料中纖維素含量最高的是()A．楊樹B．小麥

C．玉米D．棉花第三十七頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一C2、纖維素酶能夠分解()A．纖維素的微生物

B．淀粉的微生物

C．纖維素

D．淀粉第三十八頁，共四十三頁，編輯于2023年，星期一B3