新城疫抗體測定技術(shù)課件

國標(biāo)ND抗體測定技術(shù)山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院朱明恩

國標(biāo)：新城疫診斷技術(shù)（GB/T16525-2008）

2009-05-01實(shí)施本技術(shù)依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)制定是開設(shè)畜牧獸醫(yī)類專業(yè)學(xué)校學(xué)生的必會技能是新城疫抗體監(jiān)測和診斷的重要手段是2011和2012年全國農(nóng)業(yè)技能大賽的比賽項(xiàng)目，據(jù)說還將是2014年全國農(nóng)業(yè)技能大賽的比賽項(xiàng)目安排本內(nèi)容的原因新城疫抗體測定基本操作規(guī)程制備被檢血清制備1%RBC懸液HA試驗(yàn)，測病毒的血凝價配制4單位病毒HI試驗(yàn)，測血清的抗體滴度抗體滴度報告，以nlog2形式報告儀器及材料

非免疫公雞、pH7.2生理鹽水、新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原、新城標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、新城標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、3.8%的枸櫞酸鈉、96孔V型板、微量移液器、吸頭、微型振蕩器、溫箱、離心機(jī)、天平、采血器等。

心臟或靜脈采血2-3mL（不加抗凝劑），采血后使血液在采血器或滅菌干凈青霉素小瓶中凝固成斜面，室溫下2-3

小時或4℃冰箱中過夜使血清析出，也可通過離心加快血清析出。血清為淡黃色透明液體。一、制備被檢血清翅靜脈采血

針頭在靜脈血管一側(cè)傾斜刺入皮膚，再與血管平行進(jìn)針后刺入血管，見有少量回血即可采集血液，采血完成后馬上用手壓迫止血。心臟采血雞右側(cè)臥保定，上腿自然踡曲，在上腿膝關(guān)節(jié)稍前下方約1cm處（心臟搏動最明顯的部位）垂直地面進(jìn)針采血。

二、制備1％RBC懸液

1.制備抗凝血

在采血器（注射器）中吸入抗凝劑（3.8%的枸櫞酸鈉，抗凝比例為1：10），心臟或靜脈采血3-4mL，顛倒采血器使血液與抗凝劑充分混勻，然后將血液注入離心管中，用天平配平。1．離心管、離心套管和管中液體作為一個整體進(jìn)行配平2．離心管中液體不能太滿配平注意事項(xiàng)

2.離心洗滌紅細(xì)胞（1）共洗滌3次，轉(zhuǎn)速和時間均為：2000r/min、5min。（2）第1次離心時間到，用移液器吸取并棄掉上清液、白細(xì)胞和血小板，加生理鹽水，吹打混勻紅細(xì)胞，配平后進(jìn)行第2次離心，依此進(jìn)行第3次離心。（3）第3次離心時間到，吸取并棄掉上清液、白細(xì)胞和血小板后，讀出離心管中紅細(xì)胞的體積。

注意：吹打混勻紅細(xì)胞時不要太用力，以免破壞紅細(xì)胞。離心機(jī)的使用離心機(jī)放置平穩(wěn)離心管對稱放入離心機(jī)，使其處于平衡狀態(tài)按檔位依次升高轉(zhuǎn)速至所需速度。離心時間到，將轉(zhuǎn)速調(diào)為零，離心機(jī)停轉(zhuǎn)后方可取出離心管。

3.配制1%RBC懸液根據(jù)紅細(xì)胞的體積，計算所需生理鹽水量，用所需生理鹽水將紅細(xì)胞泥全部沖入小燒杯中，搖勻即可。

注意：搖勻時動作要輕柔，以防紅細(xì)胞破碎或液體外溢。紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBC血凝性病毒有相應(yīng)受體的紅細(xì)胞RBC血凝素纖突受體v血凝素纖突三、血凝試驗(yàn)（HA）1．基本原理孔號123456789101112病毒稀釋倍數(shù)生理鹽水標(biāo)準(zhǔn)抗原生理鹽水

1%RBC懸液

2122

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210211對照2525

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棄252525

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振蕩混勻，室溫即20℃～25℃下靜置40min后觀察結(jié)果。若環(huán)境溫度太高，放4℃靜置60min。生理鹽水對照孔紅細(xì)胞成明顯鈕扣狀沉到孔底時判定結(jié)果。2．操作術(shù)式（微量法，單位ul）

新的操作方法和舊版有哪些不同？生理鹽水、劑量、反應(yīng)條件HA試驗(yàn)結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全凝集：紅細(xì)胞呈傘狀均勻分布于孔底不完全凝集：介于兩者之間

病毒的HA價（血凝滴度）：能使紅細(xì)胞發(fā)生完全凝集的病毒最大稀釋倍數(shù)稱為病毒的血凝價，常用nlog2或1：xxx表示。HA試驗(yàn)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（HI同）正確使用微量移液器（吸頭固定緊，每次都要排空）；吸頭不能混用；懸滴加樣；混勻要徹底；時間和溫度合適。四、4單位病毒的配制HA試驗(yàn)，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)

用生理鹽水稀釋HA試驗(yàn)的NDV液4單位病毒液HA試驗(yàn)，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)用生理鹽水稀釋HA試驗(yàn)的NDV液HA試驗(yàn)，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)4單位病毒液用生理鹽水稀釋HA試驗(yàn)的NDV液HA試驗(yàn)，測定做NDV病毒的血凝效價血凝效價除以4即為4V的稀釋倍數(shù)介紹：回歸試驗(yàn)回歸試驗(yàn)用4V進(jìn)行的HA試驗(yàn)（用4個孔），用于檢驗(yàn)4V配制是否正確。

4V配制正確的判定標(biāo)準(zhǔn)：

前2個孔完全凝集，后2個孔不完全凝集，如下圖：

五、血凝抑制試驗(yàn)（HI）當(dāng)病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合后，病毒凝集紅細(xì)胞的能力受到抑制，稱為病毒的血凝抑制。Ag、Ab不對應(yīng)RBC抗體紅細(xì)胞凝集（HA現(xiàn)象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBCRBCv血凝性病毒血凝素纖突RBC有其受體的紅細(xì)胞血凝素纖突受體RBCv血凝性病毒血凝素纖突vvvv

Ag、Ab對應(yīng)HAHIRBC紅細(xì)胞不凝集（HI現(xiàn)象）RBCvvRBCRBC1．反應(yīng)原理孔號123456789101112生理鹽水被檢血清血清稀釋倍數(shù)4V

2525

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25502525

25

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－－

棄25

212223242526272829210

病毒鹽水對照對照

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－輕叩反應(yīng)板使反應(yīng)物混合均勻，室溫即20℃～25℃下靜置不少于30min，4℃靜置不少于60min。1%RBC懸液252525252525252525252525

振蕩混勻，室溫即20℃～25℃下靜置40min后觀察結(jié)果。若環(huán)境溫度太高，放4℃靜置60min。生理鹽水對照孔紅細(xì)胞成明顯鈕扣狀沉到孔底時判定結(jié)果。２．HI試驗(yàn)操作術(shù)式（微量法，單位ul）注意：除被檢血清外，標(biāo)準(zhǔn)陽性和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清各做一排。HI試驗(yàn)結(jié)果及規(guī)律完全不凝集：紅細(xì)胞呈明顯鈕扣狀沉到孔底完全凝集：紅細(xì)胞呈傘狀均勻分布于孔底不完全凝集：介于兩者之間

血清的血凝抑制價：能使4V凝集紅細(xì)胞的能力受到完全抑制的血清最大稀釋倍數(shù)稱該血清的血凝抑效價（HI價、抗體滴度、抗體效價）。請對左側(cè)的結(jié)果進(jìn)行抗體滴度報告結(jié)果判定（新城疫抗體測定）在生理鹽水對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果（紅細(xì)胞完全流下）的情況下，將反應(yīng)板傾斜，從背側(cè)觀察，正確判讀被檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的