提取分離鑒定的方法與技術(shù)課件

第二章天然藥物的提取分離方法對天然藥物中有效成分的提取分離存在兩種情況：第一、是目的物為已知成分或化學(xué)結(jié)構(gòu)類型，如從植物薄荷中提取分離薄荷醇或從植物中提取某類成分如總生物堿時，一般宜先查閱有關(guān)資料，搜集比較各種有關(guān)提取方案，尤其是工業(yè)生產(chǎn)方法，再根據(jù)具體條件加以選用；第二、是從天然藥物中尋找未知有效成分或有效部位時，情況較為復(fù)雜，一般應(yīng)根據(jù)預(yù)先確定的目標(biāo)，在適當(dāng)?shù)幕钚詼y試體系指引下，通過逐步提取、分離追蹤，以及相應(yīng)的動物模型篩選，臨床驗證，反復(fù)實踐，才能達到目的。本章僅就普遍應(yīng)用的提取分離鑒定的方法、原理和操作技術(shù)作一概括性的介紹。第一節(jié)天然藥物化學(xué)成分的提取方法與技術(shù)預(yù)處理：

粉碎：為了提高提取率，通常將藥材原料粉碎成粗粉，粒度并非越細越好，一般以能通過二號篩(篩孔0.9mm)為宜。脫脂：種子類藥材常先脫脂后粉碎，可選用壓榨法或石油醚脫去大量油脂。切割：水提取含纖維素、淀粉豐富的根莖類藥材時，為避免多糖遇水膨脹難濾過，宜將藥材切成小段、薄片或粉碎成粗顆粒。酶活性處理：苷類成分的提取，為防止酶的水解，可用乙醇或沸水處理，抑制或殺滅酶的活性。但苷元或次生苷的提取，則要保留酶的活性，如穿山龍中薯蕷皂苷元的提取。

—、溶劑提取法

溶劑提取法是實際工作中提取有效成分最常用的方法，根據(jù)天然藥物中各種化學(xué)成分的溶解性能，選擇對有效成分溶解度大而對其他成分溶解度小的溶劑，用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺杌瘜W(xué)成分盡可能完全地從藥材組織中溶解出來。影響提取的因素有溶劑的選擇、提取的方式、藥材的粉碎度、溫度、時間、濃度差等：其中，選擇合適的溶劑是溶劑提取法的關(guān)鍵。選擇溶劑的原則：（1）遵循“極性相似相溶”的規(guī)律，確定合適極性溶劑。（2）使用安全、易得、價廉、濃縮方便。溶劑的極性與介電常數(shù)ε有關(guān)，介電常數(shù)越大，極性越大(表2—1)。常用溶劑的極性大小順序排列如下：石油醚<苯<無水乙醚<氯仿<醋酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水影響化合物極性的因素：

(1)化合物分子母核大?。ㄌ紨?shù)多少）：分子大、碳數(shù)多，極性??；分子小、碳數(shù)少，極性大。

(2)取代基極性大?。涸诨衔锬负讼嗤蛳嘟闆r下，化合物極性大小主要取決于取代基極性大小。常見基團極性大小順序如下：酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞酮＞酯＞醚＞烯＞烷。舉例：判斷下列各組化合物極性大小。

ABC按極性大小順序，可將溶劑分為水、親水性有機溶劑、親脂性有機溶劑三類。

水的優(yōu)缺點：（1）極性強，穿透力大；（2）安全、經(jīng)濟、易得；（3）易霉變，難以保存；（4）不易濃縮和濾過。

親水性溶劑（甲醇、乙醇、丙酮等）優(yōu)缺點：（1）具有較強穿透能力，對一些親脂性成分也有很好的溶解性能，因此提取范圍較廣，效率較高；（2）提取液易于保存、濾過和回收；（3）易燃，價格較貴，有些溶劑毒性較強（如甲醇）。

親脂性有機溶劑（石油醚、苯、乙醚、氯仿、醋酸乙酯等）的優(yōu)缺點：（1）具較強選擇性，天然藥物中親脂性成份均可使用；（2）提取液易濃縮回收；（3）穿透力較弱，常需長時間反復(fù)提取，使用有一定局限性；（4）毒性大、易燃、價格較貴、設(shè)備要求高，使用時應(yīng)注意安全。因此可根據(jù)欲提取成分的特性，選擇合適的溶劑進行提取。溶劑提取法提取天然藥物化學(xué)成分，常選用的提取方法有下列幾種：

(一)浸漬法

是將藥材用適當(dāng)?shù)娜軇┰诔鼗驕責(zé)岬臈l件下浸泡一定時間，浸出有效成分的方法。

1．操作技術(shù)根據(jù)溫度條件的不同，可分為冷浸法與溫浸法兩種。

(1)冷浸法：取藥材粗粉，置適宜容器中，加入一定量的溶劑如水、酸水、堿水或稀醇等，密閉，時時攪拌或振搖，在室溫條件下浸漬1—2天或規(guī)定時間，使有效成分浸出，濾過，用力壓榨殘渣，合并濾液，靜置濾過即得。

(2)溫浸法：具體操作與冷浸法基本相同，但溫浸法的浸漬溫度一般在40—60℃之間，浸漬時間較短，能浸出較多的有效成分。由于溫度較高，浸出液冷卻后放置貯存常析出沉淀，為保證質(zhì)量，需濾去沉淀。若要使藥材中有效成分充分浸出，可重復(fù)浸提2—3次，第2、3次浸漬的時間可以縮短，合并浸出液，濾過，經(jīng)濃縮后可得提取物。

2．適用范圍適用于有效成分遇熱易破壞及含淀粉、果膠、粘液質(zhì)、樹膠等多糖物質(zhì)較多的藥材。此法操作方便，簡單易行，但提取時間長，效率低，水浸提液易霉變，必要時需加適量防腐劑如甲苯、甲醛或氯仿等。

(二)滲漉法

是將藥材粗粉置滲漉裝置中，連續(xù)添加溶劑使?jié)B過藥粉，自上而下流動，浸出有效成分的一種動態(tài)浸提方法。

1．操作技術(shù)

粉碎：先將藥材打成粗粉。浸潤：用規(guī)定量的溶劑(一般每1000g藥粉約用600—800ml溶劑)潤濕，密閉放置15分鐘至6小時，使藥粉充分膨脹。裝筒:然后取適量用相同溶劑濕潤后的脫脂棉墊在滲漉筒底部，分次裝入已潤濕的藥粉，每次裝粉后用木錘均勻壓平，力求松緊適宜，藥粉裝量一般以不超過滲漉簡體積的2／3為宜，藥面上蓋濾紙或紗布，再均勻覆蓋一層清潔的細石塊。

排氣：打開滲漉筒下部的出口，緩緩加入適量溶劑，使藥粉間隙中的空氣受壓由下口排出，待氣體排盡后，關(guān)閉出口。浸漬：流出的滲漉液倒回筒內(nèi)，繼續(xù)加溶劑使保持高出藥面，浸漬一定時間(常為24—48小時)。滲漉：控制流速，藥典規(guī)定一般以1000g藥材每分鐘流出1—3ml為慢漉，3—5ml為快漉，實驗室?？刂圃诿糠昼?～5ml之間，大量生產(chǎn)時，可調(diào)至每小時漉出液約為滲漉器容積的1／48—1／24。

收集滲漉液：約為藥材重量的8—10倍，經(jīng)濃縮后得到提取物。

2．適用范圍本法在常溫下進行，選用溶劑多為水，酸水，堿水及不同濃度的乙醇等，適用于提取遇熱易破壞的成分，因能保持良好的濃度差，故提取效率高于浸漬法，存在的不足之處為溶劑消耗多，提取時間長。連續(xù)滲漉裝置(三)煎煮法

是將藥材加水加熱煮沸，濾過去渣后取煎煮液的一種傳統(tǒng)提取方法。

1．操作技術(shù)取藥材飲片或粗粉，置適當(dāng)煎器(勿使用鐵器)中，加水浸沒藥材，加熱煮沸，保持微沸，煎煮一定時間后，分離煎煮液，藥渣繼續(xù)依法煎煮數(shù)次至煎煮液味淡薄，合并各次煎煮液，濃縮即得。一般以煎煮2～3次為宜，小量提取，第一次煮沸20—30分鐘，大量生產(chǎn)，第一次約煎煮1-2小時，第2、3次煎煮時間可酌減。

2．適用范圍此法適用于有效成分能溶于水且不易被水、熱破壞的天然藥物的提取。操作簡單，提取效率高于冷浸法。但不宜用于提取含揮發(fā)油成分及遇熱易破壞的天然藥物，含多糖類豐富的藥材，因煎提液粘稠，難以濾過，同樣不宜使用。

(四)回流提取法

使用低沸點有機溶劑如乙醇、氯仿等加熱提取天然藥物中有效成分時，為減少溶劑的揮發(fā)損失，保持溶劑與藥材長時間的接觸，通過加熱浸出液，使溶劑受熱蒸發(fā)，經(jīng)冷凝后變?yōu)橐后w流回浸出器，如此反復(fù)至浸出完全的一種熱提取方法。

1．操作技術(shù)如圖2-2所示回流提取裝置，將藥材粗粉裝入圓底燒瓶內(nèi)，添加溶劑至蓋過藥面(一般至燒瓶容積1／2—2／3處)，接上冷凝管，通入冷卻水，于水浴中加熱回流一定時間，濾出提取液，藥渣再添加新溶劑回流2—3次，合并濾液，回收有機溶劑后得濃縮提取液。

2．適用范圍本法提取效率高，但溶劑消耗量仍較大，操作較麻煩。由于受熱時間長，故對熱不穩(wěn)定成分的提取不宜采用此法?；亓魈崛⊙b置(五)連續(xù)回流提取法

是在回流提取法的基礎(chǔ)上改進的，能用少量溶劑進行連續(xù)循環(huán)回流提取，充分將有效成分浸出完全的方法。

1．操作技術(shù)實驗室中常用索氏提取器(圖2—3)提取，操作時先在圓底燒瓶內(nèi)放入幾粒沸石，以防暴沸，然后將裝好藥材粉末的濾紙袋或筒放提取器中，藥粉高度應(yīng)低于虹吸管頂部，自冷凝管加溶劑入燒瓶內(nèi)，水浴加熱。溶劑受熱蒸發(fā)，遇冷后變?yōu)橐后w回滴入提取器中，接觸藥材開始進行浸提，待溶劑液面高于虹吸管上端時，在虹吸作用下，浸出液流入燒瓶，溶劑在燒瓶內(nèi)因受熱繼續(xù)氣化蒸發(fā)，如此不斷反復(fù)循環(huán)4—10小時，至有效成分充分被浸出，提取液回收有機溶劑即得。為了防止長時間受熱，成分易被破壞，也可在提取1—2小時后更換新溶劑繼續(xù)提取。大生產(chǎn)所用及其他各種連續(xù)回流提取器的原理與索氏提取器相同。

2．適用范圍該法提取效率高，溶劑用量少，但浸出液受熱時間長，故不適用于對熱不穩(wěn)定成分的提取。連續(xù)回流提取裝置（索氏提取器）

(六)超聲提取法是一種利用超聲波浸提有效成分的方法。其基本原理是利用超聲波的空化作用，破壞植物藥材的細胞，使溶劑易于滲入細胞內(nèi)，同時超聲波的強烈振動能傳遞巨大能量給浸提的藥材和溶劑，使它們作高速運動，加強了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散和溶解，加速有效成分的浸出，極大地提高提取效率。

1．操作技術(shù)將藥材粉末置適宜容器內(nèi)，加一定量溶劑，密閉后置超聲提取器內(nèi)，選擇適當(dāng)超聲頻率提取一段時間(一般只需要數(shù)十分鐘)后即得；

2．適用范圍超聲提取法與常規(guī)提取方法相比，具有提取時間短，提取效率高，無需加熱等優(yōu)點，能避免高溫高壓對欲提取成分的破壞，既適用于遇熱不穩(wěn)定成分的提取，也適用于各種溶劑的提取。但此法對容器壁的厚薄及放置位置要求較高，目前尚為實驗室小規(guī)模使用，大規(guī)模生產(chǎn)還有待于解決設(shè)備問題。二、水蒸氣蒸餾法

水蒸氣蒸餾法用于提取具有揮發(fā)性，能隨水蒸氣餾出而不被破壞，不溶或難溶于水，與水不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的天然藥物化學(xué)成分。如揮發(fā)油、麻黃堿、檳榔堿、丹皮酚、苯醌、萘醌等。其基本原理是當(dāng)水和與水互不相溶的液體成分共存時，根據(jù)道爾頓分壓定律，整個體系的總蒸氣壓等于兩組分蒸氣壓之和，雖然各組分自身的沸點高于混合液的沸點，但當(dāng)總蒸氣壓等于外界大氣壓時，混合物開始沸騰并被蒸餾出來。裝置：水蒸氣蒸餾裝置由水蒸氣發(fā)生器、蒸餾瓶、冷凝管和接受器四部分組成。操作：將藥材粗粉裝入蒸餾瓶內(nèi)，加入水使藥材充分浸潤，體積不超過蒸餾瓶容積的1／3，然后加熱水蒸氣發(fā)生器使水沸騰，產(chǎn)生水蒸氣通入蒸餾瓶，藥材中揮發(fā)性成分隨水蒸氣蒸餾被帶出，經(jīng)冷凝后，收集于接受瓶中。餾出物與水的分離可根據(jù)具體情況來決定。注意事項：保溫，減壓。水蒸氣蒸餾裝置

三、超臨界流體萃取技術(shù)

超臨界流體萃取(SupercriticalFluidExtraction，SFE)是一種利用某物質(zhì)在超臨界區(qū)域形成的流體，對天然藥物中有效成分進行萃取分離的新型技術(shù)，集提取和分離于一體。某物質(zhì)處于其臨界溫度(Tc)和臨界壓力(Pc)以上時，形成一種既非液體又非氣體的特殊相態(tài)，稱為“超臨界流體”。此狀態(tài)下流體兼有氣液兩相的雙重特點，既具有與氣體相近的粘度，又具有與液體相近的密度，擴散力和滲透能均大大強于液體，且介電常數(shù)隨壓力增大而增加，因此對許多物質(zhì)有很強的溶解能力，可作為溶劑進行萃取。常用作超臨界流體的物質(zhì)有二氧化碳、氧化亞氮、乙烷、乙烯和甲苯等；由于二氧化碳具有無毒、不易燃易爆、安全、價廉、有較低的臨界壓力(Pc=7.37Mpa)和臨界溫度(Tc=31.4℃)、對大部分物質(zhì)不反應(yīng)、可循環(huán)使用等優(yōu)點，故最常用于天然產(chǎn)物的提取。三、超臨界流體萃取技術(shù)

超臨界流體萃取工藝程序見圖2-5。將藥材原料投入萃取器(6)中，對萃取器(6)和分離器(7)分別進行加熱或冷卻，當(dāng)達到所選定的溫度時，開啟CO2氣瓶閥門及閥門(12)進氣，啟動高壓閥(4)對系統(tǒng)加壓，當(dāng)達到預(yù)定壓力時，調(diào)節(jié)減壓閥(9)，使分離器(7)內(nèi)壓力達到設(shè)定值，打開放空閥(10)調(diào)節(jié)流量。通過各閥門的調(diào)節(jié)，使萃取過程中通過的流量及萃取器內(nèi)壓力、分離器內(nèi)壓力都穩(wěn)定在設(shè)定的操作條件后，關(guān)閉閥門(10)，打開閥門(11)，開始進行循環(huán)萃取，萃取過程中達到一定時間后，從閥門(8)取出萃取物。超臨界流體萃取裝置示意圖三、超臨界流體萃取技術(shù)

超臨界CO2萃取技術(shù)(SFE—CO2)體現(xiàn)出許多優(yōu)點。如易于操作，可調(diào)節(jié)范圍廣(常用壓力8—30MPa，溫度35-80℃)；選擇性和溶解性能好，通過調(diào)節(jié)壓力、溫度，可改變流體的極性和密度，使萃取的有效成分富集，無溶劑殘留，產(chǎn)品純度高，萃取速度快，從萃取到分離一步完成；適用于提取分離揮發(fā)性成分，脂溶性成分，高熱敏性成分及易氧化分解成分；與GC、IR、MS等聯(lián)用可快速有效地對天然物質(zhì)進行提取、分離、測定，實現(xiàn)提取與質(zhì)量分析一體化等等。已廣泛應(yīng)用于食品、香料、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域，但也有其局限性，如對極性大或分子量大的成分的萃取較難，需加入與溶質(zhì)親和力較強的夾帶劑(水、甲烷、乙醇、戊醇等)以提高溶解度，或需在很高的壓力下進行；而且所用設(shè)備屬高壓設(shè)備，投資較大，運行成本高，給工業(yè)化和普及帶來一定的難度和限制。該技術(shù)目前尚處于發(fā)展階段。

第二節(jié)天然藥物化學(xué)成分分離、精制、鑒定的方法與技術(shù)

用各種方法提取天然藥物所得的提取液是包含諸多成分的混合物，要想得到所需成分或單體化合物，尚需經(jīng)過反復(fù)的分離精制和純化處理。但提取液一般體積較大，所含成分濃度較低，因此需對提取液進行濃縮，提高濃度，以利于分離精制。濃縮可通過蒸發(fā)或蒸餾來完成，具體的方法有常壓蒸發(fā)、減壓蒸餾、薄膜蒸發(fā)、反滲透法、超濾法等。濃縮過程中應(yīng)注意盡量避免不必要的損失，防止熱敏性成分被破壞。實驗室常用的減壓蒸餾裝置見圖2-6。濃縮后的提取液進一步進行去除雜質(zhì)、分離和精制的具體方法隨天然產(chǎn)物的性質(zhì)不同而異，在分離過程中，可綜合運用多種方法，使相互融合，以達到分離目的。常用的有系統(tǒng)溶劑分離法、兩相溶劑萃取法等。減壓蒸餾裝置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮裝置一、系統(tǒng)溶劑分離法

天然藥物提取液中常含有極性不同的各種化學(xué)成分，若其中所含物質(zhì)為不明成分，常采用系統(tǒng)溶劑法進行分離。按極性由小到大的順序選用不同極性的溶劑組成溶劑系統(tǒng)，依次提取分離提取液中各種不同成分，使各溶解度有差異的成分得到分離。1、石油醚、己烷→揮發(fā)油、脂肪油、蠟、脂溶性色素、甾醇類和某些苷元等；2、乙醚、氯仿→樹脂、生物堿、苷元、醛、酮、醇、醌、有機酸和某些苷類等；3、氯仿：乙醇(2：1)→某些苷類如強心苷等；4、醋酸乙酯→中等極性成分中極性居中的某些苷類如黃酮苷等；5、正丁醇→中等極性成分中極性較大的某些苷類如皂苷、蒽醌苷等；6、丙酮、乙醇、甲醇→苷、糖類、氨基酸、某些生物堿鹽等；7、水→提取分離強親水性成分如糖類、氨基酸和無機鹽類等。

二、兩相溶劑萃取法