流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)技巧及數(shù)據(jù)分析

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)技巧及數(shù)據(jù)分析當(dāng)前第1頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)BD公司不同型號流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto當(dāng)前第2頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)一流式細(xì)胞儀的基本原理

*穩(wěn)定流動*激發(fā)光斑*熒光補(bǔ)償*熒光素選擇二數(shù)據(jù)分析及開窗當(dāng)前第3頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)FCM原理示意圖當(dāng)前第4頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)

層流是液體穩(wěn)定流動的必要條件,管道中層流的形成要滿足雷諾數(shù)

dρVRe=<2300，

η式中ρ、η分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d和V分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCM利用層流技術(shù),使細(xì)胞流動穩(wěn)定,并具有自聚焦作用,為細(xì)胞分析分選提供技術(shù)保證.

層流技術(shù)當(dāng)前第5頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)液流驅(qū)動系統(tǒng)（示意圖）

流速與壓力的關(guān)系服從Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。

當(dāng)前第6頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)當(dāng)前第7頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)

低速高速

不同樣本速率形成的樣本流

當(dāng)前第8頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)當(dāng)前第9頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn).20um64um32um032um聚焦距離激光束聚焦透鏡強(qiáng)度光束成形與細(xì)胞受照方式這種橢圓形光斑的檢測區(qū)保證每個細(xì)胞分別受到光照且受檢時受到一致的光照

FCM的單細(xì)胞照明技術(shù)當(dāng)前第10頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)當(dāng)前第11頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)熒光光譜重疊

FITC和PE熒光光譜重疊

當(dāng)前第12頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)UncompensatedvsCompensatedFL1FL2

利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的方法稱“熒光補(bǔ)償”熒光補(bǔ)償當(dāng)前第13頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)熒光補(bǔ)償當(dāng)前第14頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)Mean值判斷補(bǔ)償當(dāng)前第15頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記FITC+PE488525、575綠色、橙色FITC+Tred488525綠色

568615

紅色FITC+PeCy5488525、675綠色、紅色FITC+ECD488525、625綠色、橙紅色F+P+PeCy5488525、575、675綠、橙、紅色F+ECD+PeCy5488525、575、675綠、橙紅色、紅色F+P+PeCy5+APC488525、575綠色、橙色

633670

紅色

熒光染料激發(fā)波長（nm)發(fā)射波長（nm)顏色當(dāng)前第16頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)

用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號。LaserCY7755PEECD620CY5670488nm能量傳遞染料：當(dāng)前第17頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液制備熒光抗體標(biāo)記上機(jī)檢測表型測定細(xì)胞分選繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計(jì)學(xué)分析當(dāng)前第18頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)單分散細(xì)胞當(dāng)前第19頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)FSCFSC信號的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小和活力相關(guān)當(dāng)前第20頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)SSCSSC信號的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)顆粒多少相關(guān)當(dāng)前第21頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)細(xì)胞散色光信號當(dāng)前第22頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)細(xì)胞熒光測量細(xì)胞的自發(fā)熒光

未經(jīng)染色的樣品細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測到有微弱的熒光信號.細(xì)胞的特異性熒光

經(jīng)過各種特異染色的細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測到較強(qiáng)的熒光信號.當(dāng)前第23頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)自發(fā)熒光信號與特異染色的熒光信號分析圖自發(fā)熒光信號當(dāng)前第24頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)特異染色的熒光信號當(dāng)前第25頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)DNA分析比較當(dāng)前第26頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)排除雙聯(lián)體細(xì)胞當(dāng)前第27頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)細(xì)胞阻滯在G2M期當(dāng)前第28頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)雙克隆細(xì)胞周期分析當(dāng)前第29頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)

溴脫氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，

BrdUrd)是胸苷的一種類似物。它可以替代胸腺嘧啶摻入到細(xì)胞新合成的DNA分子中，成為S期細(xì)胞的一種標(biāo)記物。流式細(xì)胞術(shù)采用抗BrdUrd單克隆抗體免疫熒光和PI雙參數(shù)檢測細(xì)胞，不僅可檢測一個細(xì)胞群體的動力學(xué)參數(shù)和DNA含量，同時可以了解不同細(xì)胞的DNA合成能力高低。

BrdUrd和DNA雙標(biāo)記染色當(dāng)前第30頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)當(dāng)前第31頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)BrdUrd與PI檢測當(dāng)前第32頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)BrdUrd與PI檢測當(dāng)前第33頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)BrdUrd與PI檢測當(dāng)前第34頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)細(xì)胞三色熒光檢測當(dāng)前第35頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)細(xì)胞因子測定*檢測T細(xì)胞(CD69)活化當(dāng)前第36頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)G6=R1*R5當(dāng)前第37頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)*CD4抗原分子結(jié)構(gòu)引起CD4熒光強(qiáng)度下調(diào)當(dāng)前第38頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)細(xì)胞因子分析圖*過敏性鼻息肉與鼻息肉細(xì)胞因子比較當(dāng)前第39頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)純化單核細(xì)胞當(dāng)前第40頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測當(dāng)前第41頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)當(dāng)前第42頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)G3=R1*R3G4=R1*R4當(dāng)前第43頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)凋亡細(xì)胞測定當(dāng)前第44頁\共有51頁\編于星期一\6點(diǎn)凋亡細(xì)胞測定當(dāng)前第45頁\共有51頁\