紫外分光光度法和熒光分析法

紫外分光光度法和熒光分析法第一頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

基本原理儀器主要部件紫外-可見(jiàn)光分光光度法主要應(yīng)用第二頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三基本原理概述：紫外-可見(jiàn)分光光度法是通過(guò)被測(cè)物質(zhì)在紫外-可見(jiàn)光區(qū)的特定波長(zhǎng)或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。主要用于藥品的鑒別、檢查和含量測(cè)定。范圍：

可見(jiàn)光區(qū)（400~760nm）紫外光區(qū)（200~400nm）第三頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三Beer-Lambort定律*A為吸收度；*T為透光率；*E為吸收系數(shù)（以表示，溶液濃度為1%（g/ml），厚度為1cm時(shí)的吸光度值）*c為溶液濃度；*l為樣品總厚度。適用條件：入射光為單色光溶液是稀溶液固體、液體和氣體樣品在同一波長(zhǎng)下，各組分吸光度具有加和性第四頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三儀器主要部件單色器光源檢測(cè)器吸收池信號(hào)顯示系統(tǒng)光源:常采用氘燈和鎢鹵燈鎢燈最適宜的使用波長(zhǎng)范圍為320～1000nm。氘燈能發(fā)出光的波長(zhǎng)范圍一般為190～400nm單色器：棱鏡或光柵吸收池：玻璃或石英吸收池檢測(cè)器：光電池、光電管、光電倍增管及二極管陣列檢測(cè)器第五頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三儀器分類單光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)準(zhǔn)雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)第六頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三主要應(yīng)用

利用藥物與雜質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收性質(zhì)的差異，若藥物在雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處沒(méi)有吸收，則可在此波長(zhǎng)處測(cè)樣品溶液的吸收度，通過(guò)控制樣品溶液吸收度來(lái)控制雜質(zhì)的量。例：地蒽酚中二羥基蒽醌的檢查二羥基蒽醌的三氯甲烷溶液在432nm處有最大吸收，而地蒽酚在該處幾乎無(wú)吸收。1、藥物的雜質(zhì)檢查第七頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三2、藥物的含量測(cè)定如巴比妥類藥物的含量測(cè)定（巴比妥類藥物在堿性介質(zhì)中電離為具有紫外吸收特征的結(jié)構(gòu)）、芳酸及其脂類藥物含量測(cè)定、維生素A含量測(cè)定（在325~328nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)有最大吸收）等。三點(diǎn)校正法本方法是在三個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，根據(jù)校正公式計(jì)算吸光度校正值后，再計(jì)算含量。其原理主要基于以下兩點(diǎn)：①雜質(zhì)的無(wú)關(guān)吸收再310~340nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)幾乎呈一條直線，且隨波長(zhǎng)的增大吸光度下降。②物質(zhì)對(duì)光吸收呈加和性的原理，即在某一樣品的吸收曲線上，各波長(zhǎng)的吸光度是維生素A與雜質(zhì)吸光度的代數(shù)和，因而吸收曲線也是二者吸收的疊加。第八頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三3、藥物的鑒別

對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)對(duì)比吸收度（或吸收系數(shù)）的比值對(duì)比吸收光譜的一致性

例苯磺舒：用含鹽酸的乙醇[取鹽酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制成100ml]制成沒(méi)1ml中含20ug的溶液，在225nm與249nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，在249nm波長(zhǎng)處的吸收度為0.67。甾體激素類藥物：丙酸倍氯米松的乙醇溶液（20ug/ml），在239nm的波長(zhǎng)處應(yīng)有最大吸收，吸光度為0.57~0.60;在239nm與263nm波長(zhǎng)處的吸光度比值應(yīng)為2.25~2.45第九頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三1.判別物質(zhì)的異構(gòu)體，如互變異構(gòu)體，順?lè)串悩?gòu)體，開鏈和成環(huán)異構(gòu)體，旋光異構(gòu)體，空間異構(gòu)體等。反式異構(gòu)體空間位阻小，共軛程度較完全。最大吸收峰波長(zhǎng)，最大摩爾吸收系數(shù)，大于順式。2.推測(cè)物質(zhì)的共軛體系和部分骨架一般需與色譜，紅外，質(zhì)譜，波譜等多種儀器聯(lián)合作物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。4.結(jié)構(gòu)分析第十頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三紫外分光光度測(cè)定方法普通測(cè)定分光光度法1.單組分的測(cè)定通常采用A-C

標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定。2.多組分的同時(shí)測(cè)定⑴若各組分的吸收曲線互不重疊，則可在各自最大吸收波長(zhǎng)處分別進(jìn)行測(cè)定。這本質(zhì)上與單組分測(cè)定沒(méi)有區(qū)別。⑵若各組分的吸收曲線互有重疊，則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。Aλ1=εaλ1bca＋εbλ1bcbAλ2=εaλ2bca＋εbλ2bcb第十一頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三差示分光光度法普通分光光度法一般只適于測(cè)定微量組分，當(dāng)待測(cè)組分含量較高時(shí)，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。即提高入射光強(qiáng)度，并采用濃度稍低于待測(cè)溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液。設(shè)：待測(cè)溶液濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs(cs<cx)。則：

Ax=εbcx

As=εbcsΔＡ＝Ａx－Ａs=εb(cx

－cs

）=εbΔc

測(cè)得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差ΔＡ。示差法測(cè)得的吸光度與Δc呈直線關(guān)系。由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的Δc值，則待測(cè)溶液濃度cx：

cx=cs+Δc

第十二頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三雙波長(zhǎng)分光光度法不需空白溶液作參比；但需要兩個(gè)單色器獲得兩束單色光(λ1和λ2)；以參比波長(zhǎng)λ1處的吸光度Aλ1作為參比，來(lái)消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時(shí)顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測(cè)量精密度等方面都比單波長(zhǎng)法有所提高。

ΔＡ＝Aλ2－Aλ1＝（ελ2－ελ1)bc

兩波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度差值ΔＡ與待測(cè)組分濃度成正比（例子：課本366頁(yè)）第十三頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三導(dǎo)數(shù)分光光度法導(dǎo)數(shù)分光光度法在多組分同時(shí)測(cè)定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強(qiáng)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜光譜的辨析等方面，顯示了很大的優(yōu)越性。

利用吸光度(或透光度)對(duì)波長(zhǎng)的導(dǎo)數(shù)曲線來(lái)進(jìn)行分析：

Ｉ＝Ｉ0e-εbc假定入射光強(qiáng)度Ｉ0在整個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)保持恒定：

dI0/dλ＝0則：dI/dλ＝－Ｉ0bce-εbcdε/dλ

＝－Ｉ0bcdε/dλ（例子：課本233頁(yè)）第十四頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三其他卡爾曼濾波法偏最小二乘法小波變換三波長(zhǎng)分光光度法系數(shù)倍率法……第十五頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三與紫外-可見(jiàn)法異同點(diǎn)應(yīng)用熒光分析法原理第十六頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三原理熒光—分子吸收電磁波后，從其最低激發(fā)態(tài)重新發(fā)射紫外線或可見(jiàn)光的現(xiàn)象利用某些物質(zhì)被一定波長(zhǎng)的光照射后所產(chǎn)生的，能夠反映該物質(zhì)特性的熒光來(lái)進(jìn)行定性定量的分析方法——熒光分析法。在溶液中，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時(shí),其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系,即IF=KC第十七頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三

光照分子基態(tài)激發(fā)態(tài)輻射躍遷熒光若光源是：

由熒光波長(zhǎng)可確定物質(zhì)分子可見(jiàn)-紫外光源分子熒光分析法具有結(jié)構(gòu)由熒光強(qiáng)度可測(cè)物質(zhì)的含量原子特征光譜作光源原子熒光分析

X射線作光源X射線熒光分析第十八頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三第十九頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三構(gòu)件光源：為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300nm～400nm范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用。激發(fā)單色器：置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測(cè)器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜樣品室：通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。檢測(cè)器：一般用光電管或光電倍增管作檢測(cè)器?？蓪⒐庑盘?hào)放大并轉(zhuǎn)為電信號(hào)。

第二十頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三熒光分析法與紫外-可見(jiàn)分析法異同點(diǎn)熒光分析法與紫外-可見(jiàn)比較：均屬于分子光譜儀器構(gòu)造基本相似

熒光可見(jiàn)-紫外本質(zhì)發(fā)射光譜吸收光譜靈敏度10-10-10-12g/ml10-4-10-7g/ml

選擇性高一般第二十一頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三應(yīng)用硫色素?zé)晒夥y(cè)定維生素B1

維生素B1

在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，在紫（365nm）照射下呈藍(lán)色熒光（435nm）通過(guò)與對(duì)照品熒光強(qiáng)度比較。即可測(cè)得供試品含量（課本260頁(yè)）熒光分光光度法測(cè)定維生素E

采用同步熒光掃描法測(cè)定血清中維生素E，有效的消除溶劑拉曼光譜的干擾，提高靈敏度和準(zhǔn)確性。（課本277頁(yè)）第二十二頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期三時(shí)間分辨熒光光譜基于不同發(fā)光體發(fā)光衰減速度不同.壽命不同.在進(jìn)行這種測(cè)量時(shí)要求帶有時(shí)間延遲設(shè)備的脈沖光源和帶有門控時(shí)間電路的檢測(cè)器件,從而可在固定延遲時(shí)間td和門控時(shí)間tg,用發(fā)射單色器進(jìn)行掃描.可得到時(shí)間分辨發(fā)射光譜。同步掃描根據(jù)激發(fā)光和發(fā)射單色器在掃描過(guò)程中彼此間所保持的關(guān)