血型的鑒定方法及操作演示

（優(yōu)選）血型的鑒定方法及操作當(dāng)前第1頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)血型的發(fā)現(xiàn)1900年，ABO血型系統(tǒng)1940年，Rh血型系統(tǒng)

KarlLandsteiner當(dāng)前第2頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)血型（bloodtype)狹義地講，存在于紅細(xì)胞上的特異性同種抗原。廣義地講，是人類遺傳多態(tài)性的一種表現(xiàn)，血液中各種成分都有其各自型別。當(dāng)前第3頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)紅細(xì)胞血型（系統(tǒng)，抗原）是存在于紅細(xì)胞上的化學(xué)結(jié)構(gòu)，化學(xué)本質(zhì)是糖和多肽，是紅細(xì)胞膜上的跨膜蛋白。存在于紅細(xì)胞膜上（完全抗原），也存在于上皮細(xì)胞以及各種體液和分泌液中（半抗原）。RBC存在于體液、分泌液中當(dāng)前第4頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)紅細(xì)胞血型抗體天然抗體、免疫抗體規(guī)則抗體、不規(guī)則抗體完全抗體，不完全抗體同種抗體，自身抗體當(dāng)前第5頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)天然抗體和免疫抗體天然抗體：ABO血型系統(tǒng)中，A型個(gè)體血漿中天然存在抗B，B型個(gè)體血漿中存在抗A。多數(shù)天然抗體是IgM型，最佳反應(yīng)溫度為室溫或更低。免疫抗體：一般通過輸血、妊娠、注射三種方式接受抗原刺激，多數(shù)免疫抗體是IgG型，最佳反應(yīng)溫度是37oC。當(dāng)前第6頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)天然抗體和免疫抗體特性比較當(dāng)前第7頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)當(dāng)前第8頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)規(guī)則抗體和不規(guī)則抗體規(guī)則抗體：ABO系統(tǒng)產(chǎn)生抗Ａ、抗Ｂ是有規(guī)律的。

Landsteiner規(guī)律：Ａ型－抗Ｂ，Ｂ型－抗Ａ，Ｏ型－抗Ａ，抗Ｂ不規(guī)則抗體：除ABO系統(tǒng)外，其他系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體均不符合上述規(guī)律。

正常人血液中一般沒有不規(guī)則抗體，又稱為意外抗體（unexpectedantibody）。

當(dāng)前第9頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)完全抗體和不完全抗體完全抗體：在鹽水介質(zhì)中能凝集紅細(xì)胞抗體，多為IgM抗體。不完全抗體：能使紅細(xì)胞致敏，但在鹽水質(zhì)中不能凝集紅細(xì)胞，需要通過抗球蛋白法或其他非鹽水介質(zhì)法進(jìn)行檢測，多為IgG抗體。抗IgG當(dāng)前第10頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)同種抗體、自身抗體同種抗體：針對患者缺乏的抗原所產(chǎn)生的抗體即為同種抗體，如Rh陰性者輸血后產(chǎn)生的抗Ｄ抗體。自身抗體：針對自身抗原產(chǎn)生的抗體，如引起自身免疫型溶血性貧血。當(dāng)前第11頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)紅細(xì)胞血型紅細(xì)胞血型分類：

ISBT（TheInternationalSocietyofBloodTransfusion)2002年，29個(gè)系統(tǒng)，200多個(gè)抗原目前，30個(gè)系統(tǒng)，300多個(gè)抗原當(dāng)前第12頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)一、ABO血型系統(tǒng)

1.ABO血型抗原和抗體特性當(dāng)前第13頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)2.ABO血型的遺傳與生化（1）ABO基因型與表型

A型——AA，AOB型——BB，BOAB型——ABO型——O

A，B是顯性基因，O是隱性基因

ABO基因不是產(chǎn)生ABO抗原的遺傳密碼當(dāng)前第14頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)（2）ABO血型的生化合成H基因——

α

–L-fucocyltransferase，19chr

A基因——

α–N-acetyl-0-galactosaminyltransferase，9chrB基因——galactosyltransferase,9chrO基因——無效基因，不產(chǎn)生轉(zhuǎn)移酶，O型紅細(xì)胞含有H物質(zhì)基因酶合成抗原當(dāng)前第15頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)思考：A、B、AB型紅細(xì)胞是否存在H物質(zhì)？當(dāng)前第16頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)（3）ABH可溶性抗原形成分泌型血型物質(zhì)：ABH抗原存在于紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，也可出現(xiàn)在除腦脊液外的分泌液中，唾液中最豐富。Se，se基因——與體液分泌有關(guān)，Se編碼α–L-fucocyltransferase，形成分泌液中的H抗原，H也可轉(zhuǎn)化為A或B抗原，Se不影響紅細(xì)胞上ABH形成，Se為分泌型；se為非分泌型；19chr。當(dāng)前第17頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)分泌型血型物質(zhì)的意義：在RBC抗原弱表達(dá)個(gè)體中確定ABO血型。檢測唾液、羊水中的血型物質(zhì)，輔助鑒定血型和預(yù)測胎兒血型。能中和天然抗體（IgM），有助鑒別Ab性質(zhì)。當(dāng)前第18頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)3.ABO亞型：亞型：同一血型抗原的結(jié)構(gòu)、性能（質(zhì)）或抗原位點(diǎn)數(shù)（量）存在一定差異。A亞型：A1，A2，A3，Ax，Ay，AmB亞型：B1，B2，B3，Bx，Bm當(dāng)前第19頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)二、Rh血型系統(tǒng)1940年，Landerstein和Wiener用恒河猴（rhesus）RBC免疫家兔或豚鼠，得到一種抗體，可與85%白種人紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。Rh系統(tǒng)有50個(gè)抗原，最復(fù)雜，重要性僅次于ABO血型。當(dāng)前第20頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)1.遺傳與發(fā)育規(guī)律胎兒早期充分發(fā)育，臍帶血/新生兒紅細(xì)胞同成人?；蛭挥?chr，分別命名為RHD，RHCE，RHD編碼D抗原，RHCE編碼不同組合的CE抗原，ce，cE，Ce，CE。當(dāng)前第21頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)當(dāng)前第22頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)2.命名和種類三種命名方式

Fisher-Race、數(shù)字命名法、現(xiàn)代命名法當(dāng)前第23頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)Fisher-Race命名法（CDE命名法）當(dāng)前第24頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)3.Rh血型種類D、E、C、e、c抗原的強(qiáng)弱次序

D>E>C>c>e當(dāng)前第25頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)5.Rh抗體Rh抗體產(chǎn)生天然抗體罕見主要通過輸血和妊娠免疫產(chǎn)生IgG

初次免疫后3~6月出現(xiàn)，再次免疫后3周達(dá)高峰Rh抗體種類抗D，抗E，抗C，抗c，抗e當(dāng)前第26頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)ABO和Rh血型系統(tǒng)的臨床意義安全輸血的主要保證新生兒溶血病的診斷器官移植的必要條件其他：遺傳學(xué)研究，法醫(yī)學(xué)鑒定當(dāng)前第27頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)四、ABO和Rh血型鑒定常用方法：鹽水介質(zhì)法、酶介質(zhì)法、抗人球蛋白法、聚凝胺法試管法、玻片法、微柱凝膠法當(dāng)前第28頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)1.鹽水介質(zhì)法（saltmediumtest）原理：根據(jù)IgM類抗體與紅細(xì)胞膜上特異性抗原能發(fā)生凝集反應(yīng)。正定型：已知血型抗體試劑+紅細(xì)胞

反定型：已知標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞+血清鑒定紅細(xì)胞上血型抗原鑒定血清中抗體當(dāng)前第29頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)反應(yīng)條件：生理鹽水介質(zhì)，室溫，肉眼可見凝集反應(yīng)平板法，試管法，微孔板法，試管離心法最可信賴。應(yīng)用：ABO血型定型、RhD抗原定型（IgG+IgM，IgM單克隆抗體），交叉合血當(dāng)前第30頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)結(jié)果判斷當(dāng)前第31頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)注意事項(xiàng)（一）：標(biāo)準(zhǔn)血清：健康壯年人混合血清，培養(yǎng)細(xì)胞株的單克隆抗體要求：高效價(jià)：抗A、抗B≥1：128

高親和性：15s內(nèi)出現(xiàn)凝集，3min后凝集塊>

1mm2

單克隆抗體具有檢出A2，A2B的能力冷凝集素效價(jià)<

1：4

無菌，病毒滅活當(dāng)前第32頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)注意事項(xiàng)（二）：紅細(xì)胞試劑：三個(gè)健康者同型新鮮紅細(xì)胞混合，用生理鹽水洗滌三次。紅細(xì)胞懸液不能過濃或過淡，5%生理鹽水紅細(xì)胞懸液當(dāng)前第33頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)注意事項(xiàng)（三）：所有器材清潔干燥一般先加血清，后加紅細(xì)胞反應(yīng)溫度：IgM抗體反應(yīng)最適溫度為40C，為防止冷凝集素干擾，采用室溫，370C反應(yīng)減弱離心時(shí)間和速度：3000g,30s反定型不宜用玻片法結(jié)果核對，避免筆誤正、反定型結(jié)果一致才能報(bào)告，否則查找原因當(dāng)前第34頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)正反定型不一致的可能原因（一）：操作技術(shù)上的錯(cuò)誤：主要原因

離心過度或不足細(xì)胞與血清反應(yīng)比例不適當(dāng)陽性反應(yīng)產(chǎn)生溶血現(xiàn)象而未能識別漏加試劑、結(jié)果判讀錯(cuò)誤等

當(dāng)前第35頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)正反定型不一致的可能原因（二）：出現(xiàn)假陰性的常見原因：

某些白血病患者和難治性貧血等導(dǎo)致ABO抗原減弱；免疫系統(tǒng)尚未健全的新生兒、4月~6月內(nèi)嬰兒、抗體水平下降的老人；亞型紅細(xì)胞抗原性弱，難以檢出；低丙種球蛋白血癥患者，血清定型時(shí)不凝集或弱凝集。

當(dāng)前第36頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)正反定型不一致的可能原因（三）出現(xiàn)假陽性的常見原因：

紅細(xì)胞出現(xiàn)多凝集現(xiàn)象；嚴(yán)重腸道革蘭氏陰性桿菌感染，可使紅細(xì)胞獲得類B現(xiàn)象；異常的血漿蛋白升高、白蛋白/球蛋白異常，高濃度纖維蛋白原造成假凝集現(xiàn)象；待檢血清中有不規(guī)則抗體存在；右旋糖酐、靜脈注射某些造影劑等引起紅細(xì)胞類似凝集。當(dāng)前第37頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)方法學(xué)評價(jià)簡單，靈敏度低，只適合IgM抗體試管法：需時(shí)短，離心增強(qiáng)凝集，可發(fā)現(xiàn)亞型和較弱的反應(yīng)，正、反定型皆適合玻片法：適合大規(guī)模血型普查，反應(yīng)時(shí)間長，有時(shí)漏掉弱反應(yīng)，反定型不適合。當(dāng)前第38頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)2.酶介質(zhì)法（enzymicmediumtest）：原理和方法：主要用于Rh血型鑒定（IgG抗體）蛋白水解酶增強(qiáng)IgG抗體的凝集作用當(dāng)前第39頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)注意事項(xiàng)：Rh血型不需作反定型每次實(shí)驗(yàn)均需作陽性、陰性對照當(dāng)前第40頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)方法學(xué)評價(jià)簡單經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性較差，不能檢出MN、Duffy血型系統(tǒng)當(dāng)前第41頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)3.抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)（Coomb’stest）原理和方法抗IgG待測紅細(xì)胞+抗RhD（IgG）+抗人球蛋白紅細(xì)胞凝集當(dāng)前第42頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)應(yīng)用延伸：檢測紅細(xì)胞同種抗體的經(jīng)典方法，新生兒溶血、病、溶血性輸血反應(yīng)、自身免疫性溶血性貧血直接Coomb’s（directantiglobulintest,DAT）間接Coomb’s（indirectantiglobulintest,IDAT）當(dāng)前第43頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)DAT：檢查紅細(xì)胞是否致敏

當(dāng)前第44頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)IDAT：檢測血清中不完全抗體

當(dāng)前第45頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)4.聚凝胺介質(zhì)法（polybrenetest）原理和方法

低離子強(qiáng)度鹽溶液（lowionicstrengthsaltsolution,LISS)：降低介質(zhì)離子強(qiáng)度，增加抗原抗體結(jié)合

聚凝胺：中和紅細(xì)胞表面負(fù)電荷，使紅細(xì)胞發(fā)生非特異性凝集。

重懸液（resuspension)當(dāng)前第46頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)方法學(xué)評價(jià)適于各類抗體（IgM，IgG）快速、靈敏、可靠對檢測Kell血型系統(tǒng)抗體不理想，不能用肝素抗凝。當(dāng)前第47頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)5.微柱凝膠法(gelcardswithmicrotubes)1986年法國人Dr.YvesLappierre發(fā)明1994年，獲美國FDA認(rèn)證當(dāng)前第48頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)原理和方法葡聚糖做成微型凝膠柱，上端為反應(yīng)室，下端凝膠柱為抗原抗體凝集反應(yīng)的介質(zhì)?？乖c抗體結(jié)合后離心，經(jīng)過凝膠分子篩作用，游離紅細(xì)胞在凝膠底部，而與抗體結(jié)合凝集的紅細(xì)胞位于凝膠上部或懸浮于凝膠中。

反應(yīng)室凝膠柱當(dāng)前第49頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)結(jié)果判讀：陽性結(jié)果：紅細(xì)胞凝集塊位于凝膠表面或凝膠中，和（或）出現(xiàn)溶血。當(dāng)前第50頁\共有57頁\編于星期日\15點(diǎn)注意事項(xiàng)：專用水平離心機(jī)假陽性：鐮型紅細(xì)胞、巨