桔實皮中橙皮苷的提取測定及對自由基清除作用的研究

桔實皮中橙皮苷的提取測定及對自由基清除作用的研究【摘要】目的優(yōu)化分光光度法測定橙皮苷含量的實驗方法和桔實中雙氫黃酮類橙皮苷的提取工藝。方法分析方法：采用L9(34)正交實驗,考察溶劑類型、顯色時間、溫度和顯色劑用量等影響因素；提取工藝：采用L9(34)正交實驗,考察乙醇濃度、溶劑用量、提取時間和提取溫度等影響因素；參照Fenton反應原理研究不同桔實中黃酮的清除·OH中作用。結果分光光度法測定橙皮苷含量的最佳實驗條件：橙皮苷與5%Al(NO3)3溶液，在20℃反應20min，最大吸收波長為400nm；橙皮苷提取的最佳工藝條件：70%乙醇為提取溶劑，采用料液比1∶20,在50℃下中速攪拌提取3h。桔實中黃酮提取液對Fenton體系產生的·OH有一定的清除能力。結論優(yōu)選得到的提取工藝提取不同桔實中的橙皮苷，發(fā)現橘皮中橙皮苷含量最高。

【關鍵詞】橙皮苷；提取工藝；正交實驗；含量測定；自由基清除

Abstract：ObjectiveTostudythedeterminationmethodofhesperidincontentbyspectrophotometerandextractiontechnologyofhesperidinfrompeelsoftechnology:Thetypeofsolvent,temperature,quantityofindicatorandthetimeofreactionwereinvestigatedthroughorthogonaltestsofL9(34)；Extractiontechnology:Theconcentrationofethanol,quantityofethanol,timeandtemperatureofextractionwereinvestigatedthroughorthogonaltestsofL9(34).Inaddition,thescavengingeffectofflavanonefrompeelsofcitrusonhydroxylradicalwasoptimumtechnicalconditionsfordeterminingthecontentofhesperidinbyspectrophotometerwerethat:hesperidinwasimmersedwith5%Al(NO3)3at20℃for20minandthemaximumabsorbancewavelengthwas400nm；theoptimumtechnicalconditionsofextractinghesperidinwerethat:70%ethanolwasusedassolvent,andthehesperidinwasextractedat50℃for3hwhenthepowerswasstirredatmedium-speed,themassratioofpeelswghtto70%ethanolsolutionwas1:20.Inaddition,totalflavanonefrompeelsofcitrushadeffectsonscavengingofhydroxylradicals.ConclusionThecontentofhesperidininpeelsisthehighestbyimprovedextractiontechnology.

Keywords：Hesperidin；Extraction；Orthogonaltests；Determination；Scavengingofhydroxylradicals

橙皮苷即柑桔素-7-O-新橙皮糖苷,分子式C28H34O15，屬雙氫黃酮類化合物,主要存在于柑、橘、甜橙和檸檬等的果皮中。純品為白色細樹枝狀針形晶體，熔點258～262℃，2％吡啶溶液中比旋光度為-76°，相對分子量為。橙皮苷是構成Vp的主要成分，有保護毛細血管，降低毛細血管的脆性，防止微血管破裂出血的作用，作為醫(yī)藥工業(yè)用作治療高血壓病和心肌梗塞的藥物被廣泛使用［1～3］。橙皮苷不溶于乙醚、苯、丙酮及氯仿，難溶于水，微溶于乙醇、甲醇，可溶于吡啶、甘油、稀堿溶液,常用的提取方法有溶劑提取法、堿提酸沉法、超聲波提取法、微波提取法和酶解法［4］，其中溶劑提取法和堿提酸沉法操作簡單而，提取率也較高。橙皮苷結構式中存在3-羥基、C-4位羰基能與三氯化鋁或硝酸鋁生成黃色絡合物，可用分光光度法檢測［4］。本研究分別對橙皮苷絡合物的顯色條件和橙皮苷溶劑浸提工藝進行了優(yōu)化，并在此基礎上，測定了不同桔實中橙皮苷的含量，為工業(yè)生產企業(yè)挑選原材料提供依據。同時，對不同桔實提取液進行了羥自由基清除作用的研究。

1儀器與材料

儀器BS124型電子天平；HD型恒溫水浴鍋；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；UV-9100紫外/可見分光光度計；研磨機。

試劑鹽酸(37%，南京化學試劑有限公司)；乙醇(%，南京化學試劑有限公司)；七水合硫酸亞鐵；水楊酸；氫氧化鈉(%，南京化學試劑有限公司)；硝酸鋁；30%過氧化氫。以上試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

分別將試劑配成如下使用液：氫氧化鈉溶液；稀鹽酸；Al(NO3)3溶液；乙醇：(體積分數100%，70%，40%)；硫酸亞鐵溶液；過氧化氫溶液；水楊酸-乙醇溶液。

供試藥橙皮苷標準品；橘皮、貢桔皮、甜橙皮、蘆柑皮、青橙皮、檸檬皮、佛手皮，將上述7種鮮果皮自然風干，分別粉碎后密封備用。

2方法與結果

分光光度法測定橙皮苷含量的實驗條件優(yōu)化

橙皮苷標準溶液的制備準確稱取橙皮苷標準品，在超聲波作用下于無水乙醇中完全溶解并定容至100ml,橙皮苷儲備液濃度為200μg/ml。

最大吸收波長的測定橙皮苷在Al(NO3)3的蒸餾水體系中，于80℃反應15min后形成黃色絡合物，測其最大吸收波長［5］。準確移取ml橙皮苷儲備液于10ml比色管中，加入ml5%的Al(NO3)3溶液，于80℃水浴中加熱15min后，加入蒸餾水定容至10ml，以試劑做空白，測定不同波長下的吸光值，如1所示橙皮苷的最大吸收波長為400nm。

正交設計及測定結果分光光度法測定橙皮苷絡合物的吸光度，對顯色反應影響較大的因素主要有：溶劑類型、pH值、顯色時間、溫度和顯色劑用量［6，7］，本實驗采用正交篩選法選出最佳的實驗條件，各因素水平見表1所設計。分別移取橙皮苷使用液0，，，，，ml置于10ml比色管中，按照表2所設條件，加入相應Al(NO3)3溶液后，用相應的溶劑定容，配成濃度分別為0，，，，，μg/ml的使用液，顯色后在400nm下測吸光度,重復3次，取其平均值,繪制曲線可得吸光度A與橙皮苷濃度C(μg/ml)的線性回歸方程。表1正交因素水平，表2L9正交實驗及結果

實驗結果與討論根據表2極差可得，上述4種因素的主次順序為：C＞A＞D＞B，本實驗最好的線形條件是A3B1C1D3，即以蒸餾水為顯色體系，加入5%的Al(NO3)3溶液ml,在20℃反應20min，得到的標準曲線圖2所示，其線性回歸方程為：A=，r=7，說明橙皮苷的濃度C在～μg/ml濃度范圍內與吸光度A之間有較好的線性關系。

加樣回收率實驗取同一批橘皮樣品4份，分別加入橙皮苷標準品，按供試品制備，測其吸光度，計算得回收率為%～103%，平均回收率101%，RAD=%(n=4)，結果如表3所示。表3樣品橙皮苷加標回收實驗試驗號樣品含量C/μg·ml-1加入量C/μg·ml-1測得值C/μg·ml-1回收率

橙皮苷提取實驗條件優(yōu)化

橙皮苷提取工藝流程準確稱取5g左右干橘皮粉與相應料液比的不同濃度的乙醇溶液，置于裝有回流裝置的圓底燒瓶中，在相應的溫度下保溫一定時間后，過濾得橙皮苷濾液，取其濾液測定其吸光度。由于橙皮苷樣品未經脫色，本身有雜質黃色，在測定時設置試劑空白作對照，用總吸光度減去非黃酮類物質在400nm處的吸光度。

正交設計與結果測定影響橙皮苷提取效果的主要因素有浸提劑濃度、料液比、浸提溫度、浸提時間等，按以上確定的條件結合參考文獻，采用表4所示的正交實驗因素水平表，做4因素3水平的正交實驗［8～10］，實驗結果如表5所示。表4正交因素水平，表5L9正交實驗與結果實驗號A乙醇濃度

正交實驗結果分析由表5中極差R項可知，上述4種影響因素的主次順序為：B＞D＞A＞C,本實驗最佳浸提條件是A2B1C1D2，即以70%乙醇為提取溶劑，采用料液比1∶20,在50℃下提取3h，測定吸光度，得到橘皮中橙皮苷含量為%。

浸提加攪拌提取法采用浸提加攪拌提取法，以與浸提法相同的實驗條件：以70%乙醇為提取劑，料液比為1∶20，在50℃下保溫3h，同時中速攪拌粉末，測定吸光度，得到橘皮中橙皮苷含量為%。結果證明，在浸提過程中加以攪拌操作，可有效提高橘皮中橙皮苷的提取率。

不同桔實中橙皮苷含量測定

橙皮苷提取工藝準確稱取不同桔皮粉末5g和100ml70%乙醇溶液置于裝有回流裝置的圓底燒瓶中，在50℃下提取3h，同時中速攪拌。定容至100ml容量瓶中，測定不同桔皮中橙皮苷的含量。

實驗結果

經實驗測得不同桔實皮中橙皮苷含量如表6所示。表6不同桔實皮中橙皮苷含量

桔實皮中黃酮類物質清除·OH的研究

實驗方法參照Fenton反應原理及李貴榮［11］的方法改進后進行測定。利用H2O2與Fe2+混合產出·OH,但由于·OH具有很高的反應活性，存活時間短，若在反應體系中加入水楊酸，就能有效地捕捉·OH，并產生有色物質。反應

H2O2+Fe2+→Fe3++·OH+OH-

此產物在508nm處有強吸收，若在此反應體系中加入具有清除·OH功能的被測物，被測物便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色物質生產量減少。將配制好nmol/L硫酸亞鐵溶液、nmol/L過氧化氫溶液、nmol/L水楊酸-乙醇溶液、一定濃度的不同桔實提取液，按表7的順序加入到10ml的比色管中，加蒸餾水至刻度，振蕩靜置10min后以蒸餾水為參比，于508nm處測吸光度值，代入公式計算清除率。其計算公式為：

清除率=［A對照-］/A對照×100%

式中：A對照為沒有加樣品的吸光值；A樣品為加樣品的吸光值；A0為沒有加顯色劑的吸光值。表7·OH實驗加樣

實驗結果不同桔實中黃酮類物質對·OH清除作用實驗結果見表8。表8不同桔實提取液對羥自由基的清除作用

3小結

本文通過正交實驗的研究，確定了分光光度法測定橙皮苷得最佳實驗條件和橙皮苷提取的優(yōu)化工藝條件。分光光度法測定橙皮苷含量的最佳實驗條件：以蒸餾水為顯色體系，加入質量體積分數為5%的Al(NO3)3的溶液ml，在20℃中反應20min,最大吸收波長為400nm，得到橙皮苷濃度C與吸光度A的標準曲線：A=，r=7；橙皮苷提取的最佳工藝條件：以70%乙醇為提取溶劑，料液比1∶20,在50℃下中速攪拌提取3h。此法方法簡便、快速，適用于規(guī)?；纳a。

測定了不同桔實中橙皮苷的含量，研究發(fā)現橘皮中橙皮苷含量最高為%，其次是貢桔皮%和甜橙皮%，佛手皮中含量僅為%。綜合橙皮苷的提取率和生產費用，工業(yè)生產企業(yè)可以選擇橙皮苷含量較高的橘皮、貢桔皮、甜橙皮作為生產原材料。

不同桔實中黃酮類物質的提取液對羥自由基有一定的清除作用。

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