儀器及藥物分析熒光質(zhì)譜

儀器及藥物分析熒光質(zhì)譜第一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六五、熒光分子光度法（一）基本原理（二）熒光分光光度計（三）特點、方法與應用第二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六熒光（fluorescence）現(xiàn)象的第一次記錄：1575年，西班牙內(nèi)科醫(yī)生和植物學家N.Monardes，觀察到LignumNephriticum木頭切片的水溶液呈現(xiàn)天藍色。第一次被提議用于分析：1864年，Stokes第一次用于分析：1867年，Goppelsr?der根據(jù)Al-桑色素配合物的熒光，建立了Al3+的熒光測定方法。第三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六當物質(zhì)分子吸收了一定波長的紫外光能之后，基態(tài)電子躍遷到第一激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的電子首先以無輻射的方式下降到第一激發(fā)態(tài)的低能級，而后再回到基態(tài)時，所發(fā)射出的光稱為熒光。熒光是一種以光能為激發(fā)源的發(fā)射光，且波長比激發(fā)態(tài)波長更長，所以，利用物質(zhì)的熒光現(xiàn)象而建立的分析方法稱為熒光分光光度法。（一）基本原理第四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六第五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六熒光定量分析原理熒光是由物質(zhì)在吸收光能之后產(chǎn)生的發(fā)射光，其熒光強度與物質(zhì)吸收光能的程度和產(chǎn)生熒光的物質(zhì)有關。熒光效率φ——反映熒光強度的重要參數(shù)熒光強度If

應與熒光物質(zhì)的吸光強度(I0

－I

)和熒光效率φ成正比，即If=φ(I0

－I

)根據(jù)朗伯–比爾定律，和有關的運算，在一定的條件下，得：If=2.3φ

I0εcl=Kc

第六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六（二）熒光分析光度計光源激發(fā)單色器樣品池發(fā)射單色器檢測器信號處理顯示I0

IfI第七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六熒光分光光度計部件1．光源：鎢燈、汞燈、氙燈、激光激發(fā)光源應具有穩(wěn)定性好、強度大、適用波長范圍寬等特點。其中穩(wěn)定性：影響測定的重現(xiàn)性和精密度；強度：影響測定的靈敏度。2．單色器：濾光片、光柵激發(fā)單色器和發(fā)射單色器3．檢測器 PMTPhotomultiplier CCDChargeCoupledDevice CIDChargeInjectedDevice4．信號處理第八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六JobinYvonFluorolog-3熒光光譜儀1.穩(wěn)態(tài)：S/Nmin4000:1(光子計數(shù)和全反射光路)

2.10us-10s以上(磷光壽命)10ps-10us(熒光壽命)

3.波長范圍：200-900nm(UV-VIS-NIR)

4.掃描速度：150nm/s第九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六靈敏度高：比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級； 檢測下限：0.1～0.1μg/cm-3

相對靈敏度：0.05-0.005ppb（0.05MH2SO4)選擇性高重現(xiàn)性好取樣量少儀器不復雜（三）熒光分析方法的特點、方法及應用1．特點

第十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六2．方法及應用

檢測：金屬離子、有機物、生物分子生物分子相互作用研究疾病診斷定性分析：依據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)所發(fā)射的熒光波長不同；定量分析：同種物質(zhì)的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強度與濃度呈線性關系。分析方法直接熒光法（能產(chǎn)生較強熒光的藥物）間接熒光法（不能產(chǎn)生熒光或熒光很弱的藥物）第十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六第十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六第十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六六、有機質(zhì)譜法1.質(zhì)譜基本知識質(zhì)譜儀質(zhì)譜分析原理質(zhì)譜圖2.離子峰的主要類型3.有機質(zhì)譜中的裂解反應4.有機化合物的一般裂解規(guī)律和常見質(zhì)譜圖第十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六質(zhì)譜法將化合物分子在高真空條件下，用高能電子轟擊或強電場使其電離，電離產(chǎn)物按質(zhì)荷比(m/z)大小進行分離記錄所得圖譜即所謂的質(zhì)譜圖?；宓谑屙?，共七十二頁，編輯于2023年，星期六高真空條件

10-4-10-6Pa質(zhì)荷比質(zhì)量/電荷分離聚焦電離電場或高能電子轟擊(~70ev,~6,000KJ.mol-1)M＋e-→M

＋2e-

?第十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六（1）質(zhì)譜計

質(zhì)譜計須有進樣系統(tǒng)、電離系統(tǒng)、質(zhì)量分析器和檢測記錄系統(tǒng)。為了獲得良好分析，必須避免離子和氣體分子的碰撞，凡有樣品分子及離子存在和通過的地方，都處于真空狀態(tài)。進樣系統(tǒng)電離系統(tǒng)質(zhì)量分析器檢測記錄系統(tǒng)1.氣體擴散2.直接進樣3.氣相色譜1.電子轟擊2.化學電離3.場致電離和場解吸4.快原子轟擊5.電噴霧電離1.單聚焦2.雙聚焦

高真空系統(tǒng)第十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六電子轟擊利用高速電子束撞擊氣態(tài)分子，將分解出的陽離子高速導入質(zhì)量分離器中，按質(zhì)荷比（m/z）的大小順序收集，并以質(zhì)譜圖記錄下來，根據(jù)質(zhì)譜峰位置進行定性和結(jié)構(gòu)分析，或根據(jù)強度進行定量分析?；瘜W電離高能電子束和小分子反應氣體，甲烷等，反應生成初級離子，CH4+.，再和樣品分子反應，使之電離。強致電離

電場作用下，汽化樣品分子的電離第十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六場解吸不需要汽化，將樣品吸附在處理過的金屬尖端，通以微電流，金屬成為場離子發(fā)射體，使樣品解吸，離子化?？煸愚Z擊高能原子束轟擊，采用基質(zhì)負載樣品，用于不穩(wěn)定的極性分子。電噴霧電離樣品溶液在強靜電場作用下形成帶高度電荷的霧狀小液滴，溶劑不斷揮發(fā)，液滴裂分，最終形成帶電離子，可用于分子量大于20000的生物分子和絡合物分析。第十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六離子源重離子路徑離子收集器第二十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六離子源結(jié)構(gòu)第二十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六（2）質(zhì)譜分析原理

質(zhì)譜儀是利用電磁學原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進行分離的裝置。離子電離后經(jīng)加速進入磁場中，其動能與勢能相等，即(1/2)m

2=zU

質(zhì)量為m,電荷為z的正電荷離子，經(jīng)外加電場U的加速，離子的運動速度為υ。在磁場存在下，帶電離子按曲線軌跡飛行；

向心力=離心力；Hz=m

2/R第二十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六質(zhì)譜方程式：m/z=(H2R2)/2U離子在磁場中的軌道半徑R取決于：m/z、H

、U向心力=離心力；Hz=m

2/R固定U值，將H由小到大連續(xù)改變,在狹縫收集的離子的m/z比也由小到大地改變。第二十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六單聚焦質(zhì)譜計雙聚焦質(zhì)譜計第二十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六各種峰表示不同質(zhì)/荷比的離子；縱坐標以相對豐度表示，峰越高表示形成的離子越多；（即譜圖中以最強峰高為100%，分別計算其他峰強度）（3）質(zhì)譜圖基峰：質(zhì)譜圖中離子強度最大的峰第二十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六六、有機質(zhì)譜法1.質(zhì)譜基本知識2.離子峰的主要類型分子離子峰同位素離子峰碎片離子峰重排離子峰兩價離子峰3.有機質(zhì)譜中裂解反應4.有機化合物的一般裂解規(guī)律和常見質(zhì)譜圖第二十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六（1）分子離子峰質(zhì)譜信號十分豐富。分子在離子源中可以產(chǎn)生各種電離，即同一種分子可以產(chǎn)生多種離子峰，其中比較主要的有分子離子峰、重排離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰等。試樣分子在高能電子撞擊下失去一個價電子，即

M＋e-→M

＋2e-

生成的離子稱為分子離子或母離子。其中“+”代表正離子，“.”代表不成對電子。?分子離子的質(zhì)量與化合物的分子量相等。第二十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六分子離子母離子奇電子離子碎片離子+.第二十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六質(zhì)譜圖上哪個是分子離子峰，哪個是基峰？思考！13057298710141第二十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六有機化合物分子離子峰的相對強度：在質(zhì)譜中，分子離子峰的強度和化合物的結(jié)構(gòu)有關。環(huán)狀化合物比較穩(wěn)定，不易碎裂，因而分子離子較強。支鏈較易碎裂，分子離子峰就弱，有些穩(wěn)定性差的化合物經(jīng)?？床坏椒肿与x子峰。芳香化合物＞共軛鏈烯＞烯烴＞脂環(huán)化合物＞直鏈烷烴＞酮＞胺＞酯＞醚＞酸＞支鏈烷烴＞醇．第三十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六M=93Ｎ律——分子中若含有偶數(shù)個氮原子，則相對分子質(zhì)量將是偶數(shù)；反之，將是奇數(shù)。這就是所謂的“氮律”。第三十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六例如：CH4M=1612C+1H×4=16M13C+1H×4=17M+112C+2H+1H×3=17M+113C+2H+1H×3=18M+2同位素峰分子離子峰（2）同位素離子峰（M+1峰）

由于同位素的存在，可以看到比分子離子峰大一個質(zhì)量單位的峰；有時還可以觀察到M+2，M+3…….；1615m/zRA13.1121.0133.9149.2158516100171.1m/z第三十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六（3）碎片離子峰

一般有機化合物的電離能為7－13電子伏特，質(zhì)譜中常用的電離電壓為70電子伏特，過剩的能量使分子離子化學鍵斷裂，產(chǎn)生各種“碎片”離子。第三十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六H3CH3CC=O+·–CH3·CH3–C≡O+–COCH3+M+·=58m/z=43m/z=15碎片可以來剖析分子的結(jié)構(gòu)第三十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六常見丟失碎片常見穩(wěn)定離子第三十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六（4）重排離子峰當分子中裂解為碎片離子時，在鍵斷鏈的同時，分子內(nèi)部的原子或基團重排，形成隨片離子，這種離子產(chǎn)生的質(zhì)譜峰稱為重排離子峰。第三十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六（5）兩價離子峰分子受轟擊后，失去兩個電子，形成M2+離子，M2+離子產(chǎn)生的質(zhì)譜峰稱為兩價離子峰。一些雜環(huán)、芳環(huán)和高度不飽和的化合物也易形成兩價離子峰，而決大多數(shù)藥物和毒物均有雜環(huán)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)。

除上述離子峰外，還可能有亞穩(wěn)離子峰以及碎片與中性碎片反應形成的離子峰等。對于一張未知化合物的質(zhì)譜圖進行解析時，必須慎重、全面考慮。第三十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六六、有機質(zhì)譜法1.質(zhì)譜基本知識2.離子峰的主要類型3.有機質(zhì)譜中裂解反應自由基引發(fā)的裂解反應自由基引發(fā)的重排反應4有機化合物的一般裂解規(guī)律和常見質(zhì)譜圖生物質(zhì)譜第三十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六α―裂解C-Y或C=Y（Y=O，N，S）基團的化合物與這些基團相連的化學鍵斷裂。自由基或電荷定位在分子中某個特定的位置上，然后以一個電子或電子對的轉(zhuǎn)移來引發(fā)裂解反應。C的價電子基本上都用于成鍵；O，N，S有非鍵電子（1）自由基的位置引發(fā)的裂解反應第三十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六α―裂解CH3(CH2)9CH2NH2M=15730α―裂解——丟失最大烴基的可能性最大丟失最大烴基原則第四十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六麥氏重排（Mclaffertyrearrangement)位的H

轉(zhuǎn)移到雜原子上，同時鍵發(fā)生斷裂，生成一個中性分子和一個自由基陽離子（2）自由基位置引發(fā)的重排反應鍵斷裂的同時有氫原子發(fā)生轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生重排離子；第四十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六六、有機質(zhì)譜法1.質(zhì)譜基本知識2.離子峰的主要類型3.有機質(zhì)譜中裂解反應4有機化合物的一般裂解規(guī)律和常見質(zhì)譜圖烴類化合物的裂解雜原子化合物的裂解常見質(zhì)譜圖第四十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六（1）烴類化合物的裂解優(yōu)先失去大的基團，優(yōu)先生成穩(wěn)定的正碳離子。C6H5CH2+

CH2=CHCH2+

R3C+

R2CH+

RCH2+

CH3+穩(wěn)定性第四十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六①直鏈烷烴正癸烷ΔM=14M-29CH3CH2CH2+CH3CH+CH3異構(gòu)化生成穩(wěn)定的正碳離子第四十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六有m/z：29，43，57，71，……CnH2n+1系列峰ΔM=14M-29基峰為43或57第四十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六②支鏈烷烴CH3CH2CH2CH2CH3C+（CH3）2第四十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六③環(huán)烷烴環(huán)烷烴分子離子峰較強第四十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六第四十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六④烯烴41基峰是烯丙基正離子，M=41CH2=CHCH2+第四十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六⑤芳香烴第五十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六第五十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六第五十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六ΔM=14M-29基峰為43或57直鏈烷烴和支鏈烷烴質(zhì)譜圖有什么異同之處？支鏈烷烴有M-15環(huán)烷烴分子離子峰較強芳香烴芐基正離子一般是基峰（91）有苯環(huán)斷裂的特征峰77，65，37…..烯烴的基峰一般是烯丙基正離子，M=41小結(jié)第五十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六特征：m/z=31+n*14;CH2=OH；出現(xiàn)M-18峰,失去一分子的水；+（2）含雜原子化合物的裂解醇，酚，醚類的裂解第五十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六第五十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六M-18第五十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六第五十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六第五十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六芐醇：M-1峰比較強；m/z=79峰比較特征.苯酚的質(zhì)譜與芐醇會有什么不同呢？基峰第五十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六苯酚94的峰強，77的峰很弱。第六十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期六（3）常見質(zhì)譜