分子與基因工程實(shí)驗(yàn)七

分子與基因工程實(shí)驗(yàn)七第一頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日二、實(shí)驗(yàn)原理

農(nóng)桿菌重組子中攜帶經(jīng)改造的Ti質(zhì)粒（含有幫助T-DNA跳到植物染色體上的Vir區(qū)）和包含T-DNA的雙元載體pBinGUS，質(zhì)粒pBinGUS上T-DNA上插入了報(bào)告基因（GUS）和卡那霉素篩選標(biāo)記基因NPTII。葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化是通過(guò)人為在煙草葉片上產(chǎn)生傷口，侵染時(shí)農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课?，受傷后雙子葉植物分泌的酚類(lèi)化合物透過(guò)農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜，活化vir區(qū)基因，vir區(qū)基因的活化，促使T-DNA進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)移。T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到核DNA上。共培養(yǎng)可使T-DNA上攜帶的編碼抗生素的抗性基因得到表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化了的煙草外植體可在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。第二頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。具備條件：（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3）具有穩(wěn)定的外植體來(lái)源（4）對(duì)選擇性抗生素敏感（5）對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性第三頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日外植體的種類(lèi)葉片、葉柄、子葉、子葉柄莖、花莖、塊莖、莖尖分生組織根合子胚成熟種子第四頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日第五頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化雙子葉植物以葉片作為外植體，在葉片上產(chǎn)生傷口，侵染時(shí)農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课?受傷后雙子葉植物分泌的酚類(lèi)化合物透過(guò)農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜，活化vir區(qū)基因，vir區(qū)基因的活化，促使T-DNA進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)移。T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到核DNA上。

第六頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)接種菌體后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織的固體培養(yǎng)基上，在外植體細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)的同時(shí)，農(nóng)桿菌在外植體切口面也增殖生長(zhǎng)，該兩者共同培養(yǎng)過(guò)程稱之為共培養(yǎng)。是整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中非常重要的環(huán)節(jié)。因?yàn)檗r(nóng)桿菌吸附，T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在這共培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)完成。第七頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日Events

An'event'istheinsertionofaparticulartransgeneintoaspecificlocationonachromosome.Conceptions第八頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日TransformationfrequencyIndependenttransgenicplants/inoculatedimmatureembryoorcallus.Line

Theseedlingsfromonetransgeniccell,namely,oneindependentsuccessfullytransformationevent,belongtooneline,alsoarecalledclones.GenerationThesetransgenicseedlingsareT0generationseedlings,T0generationmatureseedsareT1generation…Meiosisorpollinationistheboundaryofdifferentgenerations.第九頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑儀器：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，臺(tái)式離心機(jī)，培養(yǎng)皿，加樣器及吸頭，無(wú)菌濾紙；材料：攜帶質(zhì)粒植物表達(dá)(pBI121)載體土壤農(nóng)桿菌LBA4404

煙草無(wú)菌苗試劑：

YEB液體培養(yǎng)基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，

MgSO4.7H2O0.5g,pH7.0MS鹽：

MS大量元素、微量元素、pH7.0；

MS基本培養(yǎng)基：

MS大量元素、微量元素、有機(jī)物，

3%蔗糖，0.8%瓊脂，pH5.8；第十頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)步驟第十一頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.從平板上挑取含有pBI121的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于50mlYEB液體培養(yǎng)液(含有100mg/LKan和125mg/LSm)中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8；2.4000rpm，室溫離心10分鐘，倒掉上清.3.用MS鹽溶液（pH7.0）重新懸浮菌體，侵染時(shí)采用MS鹽溶液稀釋至原體積的20-50倍。4.在超凈臺(tái)上從煙草無(wú)菌苗上切下葉片,切去邊緣和主要葉脈，切成0.4×0.6cm2大小；第十二頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日5.侵染：將切好的外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，取出外植體置于無(wú)菌濾紙上吸去材料表面的菌液。6.共培養(yǎng)，將侵染過(guò)的外植體接種在上鋪一層濾紙的MS基本培養(yǎng)基，28°C暗培養(yǎng)三天。7.外植體暗培養(yǎng)三天后，轉(zhuǎn)到含有抗生素的分化培養(yǎng)基（MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+Kan100mg/L+Cb500mg/L）上，在光照為2000-10000lx，25°C條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。8.三天觀察一次，發(fā)現(xiàn)污染，立刻轉(zhuǎn)入新的相同培養(yǎng)基中第十三頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日第十四頁(yè)，共十六頁(yè)，編輯于2023年，星期日注意事項(xiàng)1．煙草無(wú)菌苗上切下葉片后，注意迅速蓋好封口膜。2．嚴(yán)格控制葉盤(pán)在