基因操作技術(shù)詳解演示文稿

基因操作技術(shù)詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)優(yōu)選基因操作技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)

第一節(jié)

DNA克隆

1DNA克隆克隆是指遺傳上同一的生物體群體或由無性繁殖所產(chǎn)生的無性繁殖系(如株系,細(xì)胞系,菌株)DNA克隆是指含有相同DNA分子或DNA片段的的細(xì)胞群體.通過分離基因組DNA,擴(kuò)增某個(gè)特定DNA片段,轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中增殖，可制備出一個(gè)特定DNA克隆.

DNA制備是DNA克隆及其他DNA操作的第一步驟.DNA克隆的基本程序如下:當(dāng)前第3頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)DNA提取

→

分離和擴(kuò)增特定DNA片段(PCR)

載體連接

↓

↓

重組體DNA

↓轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

↓

細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)胞克隆)

克隆篩查↓(分子雜交)

↓

靶DNA克隆

↓

表達(dá)分析與功能分析

當(dāng)前第4頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)1.1DNA制備(提取)

組織細(xì)胞---→研磨破細(xì)胞---→

萃取

↓↓離心↓

分離

↓純化↓DNA樣品(

WithDNA

)當(dāng)前第5頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)1.2DNA擴(kuò)增(PCR)當(dāng)前第6頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)1.3

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是把外源DNA（重組體DNA）轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中復(fù)制的過程。靶DNA

重組載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞

分子克隆載體DNA當(dāng)前第7頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)2宿主細(xì)胞,載體及亞克隆宿主?宿主生物或細(xì)胞能夠高速率復(fù)制外源DNA.?

多數(shù)宿主是細(xì)菌(如E.coli),培養(yǎng)細(xì)胞或原生質(zhì)體.

?

宿主細(xì)胞通常需經(jīng)感受態(tài)處理才能吸收外源DNA.

載體?載體是獨(dú)立于宿主細(xì)胞的復(fù)制子.

?載體易分離,帶有選擇標(biāo)記,并容易插入外源DNA.

?

常用的載體有:質(zhì)粒,噬菌體,粘粒,細(xì)菌人工染色體和酵母人工染色體.當(dāng)前第8頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)亞克隆:

亞克隆是從一個(gè)載體中將特定克隆DNA片段轉(zhuǎn)移到另一載體的過程.克隆DNA分離→

限制酶切

→靶DNA片段分離收集

靶DNA片段純化

→

載體連接

轉(zhuǎn)化,篩選,克隆分析

亞克隆當(dāng)前第9頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)3DNA文庫(kù)

DNA文庫(kù)由一個(gè)基因組的全部DNA克隆所構(gòu)成,每個(gè)DNA克隆含有基因組DNA(基因組文庫(kù))或總cDNA(cDNA文庫(kù))的一個(gè)隨機(jī)片段.

?基因組文庫(kù):

基因組DNA→隨機(jī)片段→重組體DNA→轉(zhuǎn)化↓

基因組DNA克隆

?cDNA文庫(kù):

提取總mRNA→反轉(zhuǎn)錄為cDNA→重組體DNA

↓

轉(zhuǎn)化

↓

cDNA克隆

vectors當(dāng)前第10頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)基因文庫(kù)篩選是用分子探針或特殊蛋白質(zhì)從基因文庫(kù)中尋找特定DNA克隆的過程.DNA探針

每一克隆DNA

分子雜交(SouthernorWesternblot)

檢測(cè)與定性

克隆分析:結(jié)構(gòu)(序列)分析,功能分析(編碼蛋白質(zhì))

比對(duì)分析(同源基因).當(dāng)前第11頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)第二節(jié)質(zhì)粒載體制備DNA載體是能獨(dú)立復(fù)制并能插入外源DNA的小分子DNA理想載體的要求:

?高復(fù)制率;

?多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(每種酶一個(gè)識(shí)別位點(diǎn));

?帶有選擇性標(biāo)記(克隆篩選標(biāo)記和重組體篩選標(biāo)記);

?能容納較大的DNA片段插入.質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的小DNA分子,是最早用于基因操作的載體分子,主要用于攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá).通常將攜帶外源基因的載體稱為重組載體

(重組DNA)當(dāng)前第12頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)1質(zhì)粒?質(zhì)粒是染色體外的環(huán)狀DNA分子.

絕大多數(shù)質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌細(xì)胞中,但對(duì)細(xì)菌的代謝和生命周期是非必需的.

?質(zhì)粒的存在可能賦予宿主細(xì)胞一些特性,如抗藥性、耐逆性、接合性等.

?質(zhì)粒能獨(dú)立于宿主DNA復(fù)制.

?質(zhì)粒賦予宿主的一些特性,可作為選擇性標(biāo)記.?質(zhì)粒根據(jù)其復(fù)制特性可分為兩類:

嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(低復(fù)制率);

松馳型質(zhì)粒(高復(fù)制率).

當(dāng)前第13頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)重組體篩選

雙標(biāo)記,負(fù)選擇當(dāng)前第14頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)重組體篩選

藍(lán)白斑當(dāng)前第15頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)2質(zhì)粒制備

培養(yǎng)含所需質(zhì)粒的細(xì)菌株系;離心收集細(xì)菌沉淀物,再懸浮;堿裂解部分破壁增加細(xì)胞透性:

懸浮培養(yǎng)→裂解液→中和→離心→收集上清液

酚萃取除去蛋白質(zhì);乙醇沉淀,收集質(zhì)粒DNA;DNA純化:CsCl2

梯度離心(大量制備用)

緩沖液溶解,酚/仿萃取,乙醇沉淀

當(dāng)前第16頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)質(zhì)粒

DNA

制備工藝當(dāng)前第17頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳+當(dāng)前第18頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)第三節(jié)限制性內(nèi)切酶及酶切片段凝膠電泳1限制性DNA內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶催化從DNA分子內(nèi)部水解磷酸二酯鍵,切斷雙鏈DNA限制性內(nèi)切酶有特定的識(shí)別位點(diǎn),且不同的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)的序列各不相同.

限制

-

修飾系統(tǒng)是生物體的主要防御機(jī)制:

?限制性內(nèi)切酶在特定位點(diǎn)切割外來DNA,切割后的DNA片段再被其他的DNase完全水解;?甲基化酶給自身DNA的識(shí)別位點(diǎn)上的C或A堿基加上甲基,使限制性內(nèi)切酶不能催化該位點(diǎn)DNA水解,從而保護(hù)宿主DNA免受破壞.

當(dāng)前第19頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)限制性內(nèi)切酶的分類:TypeI有特定識(shí)別位點(diǎn)但隨機(jī)切割.TypeII有特定識(shí)別位點(diǎn)且在同一位置切割.TypeIII有特定識(shí)別位點(diǎn)但在之外幾個(gè)堿基處切割DNA.

限制性內(nèi)切酶TypeII

的作用特點(diǎn)：識(shí)別位點(diǎn)是回文序列.切割后產(chǎn)生粘性末端(3`-突出或5`-突出),可進(jìn)行退火堿基配對(duì)并用DNA連接酶修復(fù)連接.少數(shù)限制性內(nèi)切酶切割后可產(chǎn)生平端(鈍端),須用特殊的DNA連接酶(如T4

DNA連接酶)連接.當(dāng)前第20頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)

當(dāng)前第21頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)2瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)體系:瓊脂糖(0.5-2.0%);緩沖液(約pH8.0);DNA樣品(上樣緩沖液

+

DNA

+

EB

或其他染色劑);電場(chǎng)(

約100V

).當(dāng)前第22頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)注意事項(xiàng):在高pH條件下,所有DNA分子在緩沖液中均帶負(fù)電荷,在電泳過程中將向正極遷移.遷移率與DNA分子的大小(長(zhǎng)度)成正相關(guān).相同大小的DNA在超螺旋狀態(tài)下的電泳遷移快于線性DNA和環(huán)狀DNA,線性DNA的電泳遷移快于環(huán)狀DNA.較大的DNA分子須在較低濃度的凝膠上進(jìn)行電泳,較小的DNA分子可用較高濃度的凝膠.當(dāng)DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),其電泳遷移明顯地減緩（凝膠阻滯）.當(dāng)前第23頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)Electrophoretogram酶切片段的電泳分離當(dāng)前第24頁\共有28頁\編于星期四\21點(diǎn)從瓊脂糖凝膠中分離特定的DNA片段:

?切膠,熔解凝膠和去除EB;

?酚/仿萃取、離心收集和純化DNA。

熔膠和去EB

Targe