實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)全面分析演示文稿

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)全面分析演示文稿當(dāng)前第1頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)目錄實(shí)時(shí)定量PCR基本原理實(shí)時(shí)定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理實(shí)時(shí)定量PCR兩種相對(duì)定量方法比較實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)實(shí)例分析實(shí)時(shí)定量PCR常見故障排查實(shí)時(shí)定量PCR的新應(yīng)用當(dāng)前第2頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)實(shí)時(shí)定量PCR基本原理當(dāng)前第3頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)常規(guī)vs實(shí)時(shí)常規(guī)PCR：借助電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對(duì)起始模板的定量分析當(dāng)前第4頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)常規(guī)vs實(shí)時(shí)優(yōu)缺點(diǎn)比較

定量PCR

常規(guī)PCR靈敏度高高精確度安全省時(shí)只能進(jìn)行半定量或定性分析不安全易污染費(fèi)時(shí)費(fèi)力當(dāng)前第5頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)定量PCR三個(gè)基本概念擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期

平臺(tái)期線性增長(zhǎng)期背景期當(dāng)前第6頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)閾值與C(t)值閾值：是循環(huán)開始3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，設(shè)定在擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期C(t)值：熒光信號(hào)（擴(kuò)增產(chǎn)物）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04當(dāng)前第7頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)定量PCR的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0×2n非理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: logXn=log(X0(1+Ex)n)

整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn將C(t)和達(dá)到C(t)值時(shí)終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得：

logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+logXc(t)

初始濃度的對(duì)數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率當(dāng)前第8頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)熒光強(qiáng)度---循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)---C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210C(t)與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系當(dāng)前第9頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)定量原理濃度的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)（Ct值）就可分析樣品中起始模板量當(dāng)前第10頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)化學(xué)原理化學(xué)方法分類非特異性SYBRGreenI法特異性TaqMan探針法當(dāng)前第11頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)SYBRGreenI法結(jié)合雙鏈DNA分子小溝延伸結(jié)束，形成雙鏈DNA，SYBRGreen結(jié)合到雙螺旋小溝中，當(dāng)受到適合光源激發(fā)，發(fā)射出熒光，反映產(chǎn)物濃度優(yōu)點(diǎn)使用方便，無需復(fù)雜的設(shè)計(jì)成本較低缺點(diǎn)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，無模板特異性試驗(yàn)方法較難優(yōu)化靈敏度低當(dāng)前第12頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)TaqMan探針法水解型報(bào)告基團(tuán)，淬滅基團(tuán)FRET（熒光諧振能量傳遞）識(shí)別特異性產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)特異性高，可準(zhǔn)確定量靈敏度高設(shè)計(jì)不同標(biāo)記的探針，可進(jìn)行多重檢測(cè)缺點(diǎn)一個(gè)探針只適用于一個(gè)目標(biāo)價(jià)格較高探針設(shè)計(jì)較繁瑣當(dāng)前第13頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)兩種化學(xué)的比較化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑信號(hào)檢測(cè)階段SYBRGreenI結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中否延伸TaqMan水解型雜交探針（5‘-3’外切）有任何步驟當(dāng)前第14頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理絕對(duì)定量與相對(duì)定量當(dāng)前第15頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)絕對(duì)定量與相對(duì)定量絕對(duì)定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度（DNA，RNA）相對(duì)定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對(duì)含量當(dāng)前第16頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)定量PCR--絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)值unknown104103當(dāng)前第17頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)使用定量PCR進(jìn)行絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)敏感性高檢測(cè)低拷貝數(shù)樣品：?jiǎn)慰截惔蠓秶截悢?shù)樣品同時(shí)檢測(cè)100—1010省時(shí)有效當(dāng)前第18頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)定量PCR--相對(duì)定量相對(duì)定量的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）相對(duì)定量的問題樣品材料不均一造成的差別內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)要相對(duì)恒定，表達(dá)不受處理因素影響）對(duì)目的基因進(jìn)行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的誤差當(dāng)前第19頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)SYBRGreenI法進(jìn)行相對(duì)定量的問題問題：SYBRGreenI可以與非特異性雙鏈結(jié)合非特異產(chǎn)物信號(hào)結(jié)果不準(zhǔn)確解決辦法：引入熔鏈曲線分析當(dāng)前第20頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)熔鏈曲線分析在PCR反應(yīng)程序結(jié)束后，逐步提高溫度，讀取熒光值，得到溫度與熒光值的關(guān)系曲線溫度熒光信號(hào)強(qiáng)度TmTm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度-dIdTTm當(dāng)前第21頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)熔鏈曲線分析決定退火溫度Non-specificproductspecificproductspecificproduct當(dāng)前第22頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)實(shí)時(shí)定量PCR兩種相對(duì)定量方法比較相對(duì)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和2-ΔΔc(t)

法當(dāng)前第23頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線處理與未處理樣品同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得C(t)值用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因C(t)值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達(dá)差異當(dāng)前第24頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)適用范圍目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異較大擴(kuò)增效率較低當(dāng)前第25頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)2-ΔΔc(t)

法公式推導(dǎo)M:目標(biāo)基因，N：內(nèi)標(biāo)基因XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值)(1)XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值)(2)均一化(1)/(2):X0M/X0N=2C(t)N-C(t)M=2-ΔC(t)處理2與處理1相比：

(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-ΔC(t)2-ΔC(t)1=2-ΔΔC(t)ΔΔC(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)當(dāng)有多個(gè)樣品時(shí)（如時(shí)間點(diǎn)），各樣品均一化后都與同一時(shí)間點(diǎn)相比當(dāng)前第26頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)一般步驟選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因設(shè)計(jì)一步法或兩步法RT-PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)獲得及處理目標(biāo)基因C(t)值（處理，未處理）內(nèi)標(biāo)基因C(t)值（處理，未處理）計(jì)算2-ΔΔc(t)

作圖當(dāng)前第27頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)適用范圍當(dāng)擴(kuò)增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率比較一致★不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測(cè)當(dāng)前第28頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率的快速檢測(cè)通過并列跑兩條擴(kuò)增曲線，查看指數(shù)增長(zhǎng)期的曲線之間是否平行當(dāng)前第29頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)?zāi)康幕蚝蛢?nèi)參基因擴(kuò)增效率一致性檢測(cè)檢測(cè)目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因在不同稀釋濃度下的ΔC(t)，以稀釋倍數(shù)與ΔC(t)作圖，當(dāng)直線的斜率近似于0（絕對(duì)值要小于0.1）時(shí)，說明目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率一致。當(dāng)前第30頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)問題與解決為保證擴(kuò)增效率一致擴(kuò)增子長(zhǎng)度引物設(shè)計(jì)模板純度、復(fù)雜度等反應(yīng)條件當(dāng)前第31頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)定量PCR實(shí)驗(yàn)實(shí)例分析

當(dāng)前第32頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)利用TaqMan法研究ERBB2在正常或乳腺腫瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法）已知在50%的乳腺腫瘤樣本中，ERBB2表達(dá)異常，因此可以作為一個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)選用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因FAM標(biāo)記的ERBB2探針VIC標(biāo)記的GAPDH探針構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線雙重PCR反應(yīng)陰性對(duì)照無RNA對(duì)照（空白）無逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照（基因組）當(dāng)前第33頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2當(dāng)前第34頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)樣品擴(kuò)增：正常vs腫瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH腫瘤腫瘤正常正常當(dāng)前第35頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0426.24±0.17ERBB2表達(dá)MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8628.34±0.1026.83±0.03GAPDH表達(dá)當(dāng)前第36頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/μlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011＝1.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression當(dāng)前第37頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)（2-ΔΔc(t)

法）ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t)結(jié)果與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相近HealthyRNABBER2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNABBER2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.21當(dāng)前第38頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)實(shí)時(shí)定量PCR常見故障排查當(dāng)前第39頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)故障排查---軟件界面擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線原始數(shù)據(jù)當(dāng)前第40頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)擴(kuò)增曲線當(dāng)前第41頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)異常擴(kuò)增曲線當(dāng)前第42頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)擴(kuò)增曲線基線設(shè)置是否正確

基線校準(zhǔn)

基線開始值(3-10)

基線終止值（指數(shù)期之前）閾值設(shè)置是否正確

設(shè)置在指數(shù)增長(zhǎng)期(可自動(dòng)或手動(dòng)設(shè)置）當(dāng)前第43頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)當(dāng)前第44頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)當(dāng)前第45頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線當(dāng)前第46頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)原始數(shù)據(jù)當(dāng)前第47頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)常見問題抑制物PCR前精密度差擴(kuò)增曲線異常PCR后標(biāo)準(zhǔn)曲線差當(dāng)前第48頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)抑制物PCR抑制物

多糖類、有機(jī)溶劑、蛋白酶K等樣本質(zhì)量A260/A280----DNA:≥1.8----RNA:≥2.1RT反應(yīng)中的抑制物----RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

當(dāng)前第49頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)PCR抑制物抑制物？當(dāng)前第50頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)樣本質(zhì)量起始模板量越高，抑制物含量越高當(dāng)前第51頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線當(dāng)前第52頁\共有61頁\編于星期四\22點(diǎn)精密度差精密度高精密度低40次相同的重復(fù)3次相同的重復(fù)