毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)微核試驗(yàn)

毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)微核試驗(yàn)第一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)小鼠骨髓微核試驗(yàn)原理

掌握微核試驗(yàn)的制片方法

學(xué)習(xí)掌握微核的觀察計(jì)數(shù)

掌握微核試驗(yàn)的結(jié)果分析評(píng)價(jià)4123第二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一實(shí)驗(yàn)原理微核(Micronucleus)的產(chǎn)生與染色體損傷有關(guān)微核是在細(xì)胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)，仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無著絲粒斷片或環(huán)。它在末期以后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成，由于比核小得多故稱微核。第三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一微核試驗(yàn)(Micronucleustest，MNT)是觀察受試物能否產(chǎn)生微核的試驗(yàn)。其主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。

微核可出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中較難與正常核的分支相區(qū)別，由于紅細(xì)胞在成熟前最后一次分離后數(shù)小時(shí)可將主核排出，而仍保留微核于PCE細(xì)胞中，因此，通常計(jì)數(shù)PCE細(xì)胞中的微核數(shù)。第四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一實(shí)驗(yàn)原理第五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一器材與試劑

器材

手術(shù)刀、手術(shù)剪、無齒鑷、小型彎止血鉗、干凈紗布、晾片架、玻璃蠟筆、玻璃染色缸、1ml注射器及針頭、載玻片及推片、帶油鏡頭顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)器。第六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一器材與試劑試劑甲醇(分析純)、甘油(分析純)、小牛血清、生理鹽水、Giemsa儲(chǔ)備液(取Giemsa染料1g，甘油66m1，甲醇60m1)、pH6.8的磷酸鹽緩沖液。第七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一器材與試劑陽性對(duì)照物

環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C第八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一

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3試驗(yàn)動(dòng)物及處理

觀察計(jì)數(shù)

骨髓液的制備和涂片

操作步驟第九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一操作步驟1、試驗(yàn)動(dòng)物及處理

(1)動(dòng)物選擇：一般常用的試驗(yàn)動(dòng)物為大、小鼠。以小鼠使用最為廣泛，要求體重18~20g，7~12周齡。每組小鼠數(shù)量10只，雌雄各半。

第十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一操作步驟

(2)染毒途徑：根據(jù)研究目的或受試化學(xué)毒物性質(zhì)的不同，可分別選用經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道及注射等染毒途徑。但原則上應(yīng)盡可能采用與人體接觸化學(xué)毒物相同的途徑。第十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一操作步驟

(3)染毒次數(shù)及取樣時(shí)間：采用兩次染毒的方式，即第一次

染毒24小時(shí)后，進(jìn)行第二次染毒，6小時(shí)后取樣。第十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一操作步驟(4)劑量選擇：受試物應(yīng)至少設(shè)三個(gè)劑量組，最高劑量組原則上為不產(chǎn)生動(dòng)物死亡的最大毒作用劑量。一般取受試樣品1/5、1/10、1/20LD50劑量。陽性對(duì)照組可用環(huán)磷酰胺(50~100mg/kg)或絲裂霉素C(10mg/kg)腹腔注射1次或2次。陰性對(duì)照組使用等體積的溶劑。第十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一2、骨髓液的制備和涂片

試驗(yàn)動(dòng)物最后一次染毒后，按確定的時(shí)間用頸椎脫臼或麻醉的方法將其處死，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕，剖開胸腹部，取下胸骨(或股骨），擦凈血污，剔去肌肉，剪去骨骺。用小型彎止血鉗將骨髓擠于有一滴小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片。第十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一操作步驟第十五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一操作步驟3、固定

將推好晾干的骨髓片放入染色缸中、用甲醇溶液固定15min取出晾干。不能及時(shí)染色的涂片也應(yīng)固定后保存。

第十六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一操作步驟4、染色

將固定晾干后的涂片、用新鮮配制的Giemsa應(yīng)用液(Giemsa儲(chǔ)備液1份加PH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色10~15min，然后沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。

第十七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一操作步驟5、觀察計(jì)數(shù)

先在低倍鏡下進(jìn)行觀察，選擇分布均勻．染色較好的區(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)，PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞(NCE)呈橘黃色。細(xì)胞中含有的微核多數(shù)呈圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)微核。計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE中含微核的PCE數(shù)，并且計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中PCE與NCE的比值。

第十八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一第十九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一第二十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一MNNCEIllustrationofabinuclearhumanlymphocytecontainingamicronucleus(arrow).Nuclearmaterialappearsinyellow,cytoplasminred.Acridin-Orangestaining,fluorescencemicroscopy,enlargement1000fold第二十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一結(jié)果與分析本試驗(yàn)中只計(jì)數(shù)PCE中的微核，微核率以千分率表示。每只動(dòng)物為一觀察單位。每組的雌、雄動(dòng)物分別計(jì)算微核PCE的均值。雌、雄動(dòng)物之間無明顯的性別差異時(shí)可合并計(jì)算結(jié)果，否則應(yīng)分別進(jìn)行計(jì)算；正常的PCE/NCE比值約為l

(正常范圍為0.6~1.2)。如比值＜0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制，受試化學(xué)毒物的劑量過大，試驗(yàn)結(jié)果不可靠。陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組的微核發(fā)生率，應(yīng)與試驗(yàn)所用動(dòng)物種屬及品系的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果或者是與研究的歷史數(shù)據(jù)相一致。

第二十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一結(jié)果與分析微核試驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)資料的頻數(shù)分布尚無定論，多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(如泊松分布、二項(xiàng)分布、χ2檢驗(yàn)等)均有人用于試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。該試驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是制作良好的骨髓涂片及優(yōu)質(zhì)的染色。第二十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期一(1)坐姿：端坐于實(shí)驗(yàn)臺(tái)前，將顯微鏡直立放置，以免鏡油流掉影響觀察或造成污染。(2)識(shí)別油鏡頭：油鏡頭上一般有“×100”，“Oil”等標(biāo)記。(3)對(duì)光：低倍鏡對(duì)光，取得最大亮度。(4)滴加香柏油：將標(biāo)本滴加香柏油一滴，油鏡檢查。(5)調(diào)焦距：將油鏡鏡頭移至中央對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本，從側(cè)面注視鏡頭，并緩慢向下轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋，使鏡筒下降，直至鏡頭浸于香柏油中并幾乎接觸到標(biāo)本為止。然后將視線移至目鏡，一面觀察一面向上慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋，待看到模糊的物象時(shí)，改用細(xì)螺旋直至看清物象。(6)清潔保養(yǎng)：