第八章外源基因表達產物的分離純化

第八章外源基因表達產物的分離純化第一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五一、重組蛋白分離純化方法選擇的基本原則針對不同的產物表達形式采取不同的策略針對不同性質的重組蛋白選擇不同的層析類型多種分離純化技術的聯合運用合適分離純化介質的選擇分離純化過程的規(guī)模化第二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五1.針對不同的產物表達形式采取不同的策略采用分泌型戰(zhàn)略表達重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進行濃縮處理；采用包涵體型戰(zhàn)略表達重組蛋白，應先離心回收包涵體；采用融合型戰(zhàn)略表達重組蛋白，一般是胞內可溶性的，擬首先選用親和層析進行純化

表達在細胞膜和細胞壁之間的間隙中的蛋白質，應用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。第三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五2.針對不同性質的重組蛋白選擇不同的層析類型

等電點處于極端區(qū)域（pI≤5

或pI≥8）的重組蛋白應首選離子交換法進行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白；重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親合層析

疏水層析和反相層析是根據蛋白質的疏水性差異進行分離的；

凝膠過濾層析是根據蛋白的分子量和體積差異進行分離的；第四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五3.多種分離純化技術的聯合運用在選擇分離純化方法時應遵循下列原則：應選擇不同分離純化機理的方法聯合使用應首先選擇能除去含量最多雜質的方法應盡量選擇高效的分離方法應將最費時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段第五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五4.合適分離純化介質的選擇常用的蛋白質分離純化介質有Sephadex和Superose。理想的分離純化介質應具有下列性質：對目標蛋白具有較高的分離效率對目標蛋白不會造成變性化學性能和機械性能穩(wěn)定，重復性好價格低廉第六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Sephadex

是由葡聚糖通過環(huán)氧氯丙烷交聯形成的三維網狀凝膠顆粒Superose是在珠狀瓊脂糖顆粒的基礎上經過兩次交聯后得到的第七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五5.分離純化過程的規(guī)?；鞍踪|分離純化的實驗室工藝、技術、方法在大規(guī)模產業(yè)化過程未必合適，如：實驗室方法在工程上可能難以實現（超聲波破細胞壁）實驗室方法在大規(guī)模生產中可能成本過高（超速離心）因此，在很多情況下，實驗室的技術路線不等于生產工藝。第八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五1.離子交換層析二、常用的分離方法離子交換層析的基本原理離子交換介質的基本性質離子交換層析的基本操作離子交換介質的選擇原則第九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五離子交換層析的基本原理離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結合力的差異，而將混合物進行分離的層析技術。第十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五離子交換介質的基本性質離子交換劑亦稱離子交換介質，通常是一種不溶性高分子化合物如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等；

離子交換劑中所含的可解離基團在水溶液中能與溶液中的其它陽離子交換劑的基本性能離子或陰離子起交換作用不同蛋白質與離子交換劑之間形成離子鍵數目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當的洗脫條件便可將混合物中的成分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的第十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

陰離子交換劑：強堿型和弱堿型離子交換劑的分類

陽離子交換劑：強酸型和弱酸型第十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五陽離子交換劑

分為強酸型、中強酸型和弱酸型三類，強酸型含有－R－SO3H，中強酸型含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型含有－COOH或－OH。

陽離子交換進行的反應如下：第十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五陰離子交換劑

分為強堿型、中強堿型和弱堿型三類，含有四級銨鹽[－N+(CH3)3]為強堿型，三級以下銨鹽[－N(CH3)2]、[－NHCH3]、[－NH2]都屬弱堿型；同時具有強堿和弱堿型基團的，為中強堿型。

陰離子交換樹脂進行的反應如下：

第十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五強離子交換劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的pH范圍小弱酸性陽離子交換劑在pH值降低時，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱弱堿性陰離子交換劑在pH值升高時，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱第十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五常用的離子交換劑離子交換樹脂：最常見的離子交換樹脂是含有酸性或堿性基團的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物離子交換樹脂的優(yōu)點是：流速快，對小分子物質的交換容量大，因而適合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物質的分離純化第十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五離子交換纖維素：

離子交換纖維素是攜帶功能基團纖維素衍生物，具有松散的親水性網狀結構以及較大的表面積，大分子可以自由通過，因而對生物大分子（如蛋白質）的交換容量比離子交換樹脂大

陽離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等維素）

陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖第十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五離子交換葡聚糖：離子交換葡聚糖是葡聚糖經環(huán)氧氯丙烷交聯后形成的具有多孔三維空間網狀結構并帶有離子交換功能基團。Sephadex的優(yōu)點如下：親水性強、不會引起生物分子的變性和失活，母鏈對蛋白質、核酸及其它生物分子的非特異性吸附能力小電離基團在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便，流速快既有離子交換作用，又有分子篩效應因而Sephadex是一類廣泛應用的色譜分離介質第十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

常用的離子交換葡聚糖包括：陽離子交換劑

CM-SephadexC-25，CM-SephadexC-50陰離子交換劑 DEAE-SephadexA-25，DEAE-SephadexA-50

QAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-50

第十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五離子交換瓊脂糖：

離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團的SepharoseCL-6B尤其是介質受pH和離子強度的影響所引起的膨脹和收縮效應較小，因具有硬度大、性質穩(wěn)定，流速好，分離能力強等優(yōu)點此具有穩(wěn)定的外形體積第二十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五離子交換介質的選擇原則一般而言：酸性物質用陰離子交換劑分離氨基酸、核苷酸、蛋白質等兩性電解質，可根據其pI值及離子化堿性物質用陽離子交換劑分離曲線來選擇第二十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五12346789105pH+-蛋白質凈電荷等電點吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）對pI=5的某酸性蛋白質在pH5.5-9.0的范圍內，當蛋白質為陰離子時，應首選DEAE纖維素；在pH3.5-4.5的范圍內，當蛋白質為陽離子時，應首選CM纖維素第二十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五離子交換層析的基本操作(1)層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的2倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點以流出液的離子濃度、導電性、pH值與緩沖液一致為準，其中pH值最重要目的：保證待分離物質如蛋白質的穩(wěn)定；使各個待分離物質與離子交換劑有適當的結合；使待分離樣品和雜質與離子交換劑的結合有較大的差別。第二十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五(2)樣品進柱為了達到滿意的分離效果，進樣量一般為介質交換容量的10-20%為了避免進樣溶液中的離子強度過高，樣品濃度不宜太高交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團的總數第二十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五離子交換層析的基本操作(3)樣品洗脫恒定洗脫階段洗脫梯度洗脫102030405060708090分子濃度離子強度pH值第二十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五1.平衡階段:離子交換劑與反離子結合2.吸附階段：樣品與反離子進行交換3、4.解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質，后洗下強吸附物質5.再生階段：用原始平衡液進行充分洗滌，既可重復使用12345原始緩沖溶液的反離子樣品溶液梯度濃度第二十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五時刻要記?。旱鞍踪|是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白質也存在等電點（pI），蛋白質在溶液中帶電狀況同氨基酸相同，取決于所處溶液的pH

值。當pI<pH時，蛋白質帶凈負電荷；而當

pI>pH時，蛋白質帶凈正電荷。舉一例子：已知蛋白X等電點為7，設計實驗利用陰離子交換樹脂純化。答案：建立陰離子交換柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的緩沖液平衡柱子，同時蛋白X溶解于pH8.5的緩沖液中，在此pH值下蛋白X帶有負電，將含有蛋白X的混合液上樣，然后用起始液沖洗，蛋白X會與此柱結合，然后鹽梯度洗脫。第二十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五2.凝膠層析凝膠層析的基本原理凝膠介質的基本性質凝膠層析的基本操作凝膠介質的選用原則第二十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五凝膠層析的基本原理凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對混合物中各組份按分子大小進行分離的層析技術，又稱為分子篩。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，會被全部排阻在凝膠顆粒之外，即全排阻；鑒于上述原理，凝膠層析可用于重組蛋白溶液脫鹽、分子量測定以及分離純化。第二十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五凝膠過濾的作用機制第三十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五帶網孔的葡聚糖珠小分子進入葡聚糖珠內大分子不能進入珠內，經珠之間縫隙流出凝膠過濾層析過程示意圖第三十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質凝膠珠第三十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第三十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第三十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第三十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第三十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五凝膠介質的基本性質葡聚糖凝膠的種類有G10、G15、G25、G50、G75、G100

葡聚糖凝膠對堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110℃，干的則能耐受120℃高溫葡聚糖凝膠（Sephadex）葡聚糖凝膠G10＜700

葡聚糖凝膠G15＜1500

葡聚糖凝膠G251000-5000

葡聚糖凝膠G501000-30,000第三十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠，常見的有Sepharose（Sepharose2B、4B、6B）。瓊脂糖凝膠

當溫度高于50℃時瓊脂糖凝膠便融化，只能在較低的溫度下使用。瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，因而適合于分離分子量較大的生物大分子物質（如蛋白質和DNA）。第三十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯而成的人工合成凝膠，控制交聯劑的用量可制成各種型號的凝膠，交聯劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel，型號從P-2至P-300共10種聚丙烯酰胺凝膠第三十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五凝膠介質的選用原則將樣品中的大分子物質與小分子物質分開，稱為組別分離，其分離策略是使高分子物質完全被排阻，小分子物質完全滲入凝膠內。

組別分離一般選用SephadexG-25或G-50，對于小肽和低分子量的物質（分子量范圍1000-5000）的脫鹽可選用SephadexG-10、G-組別分離15、Bio-GelP-2或P-4第四十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五將樣品中一些分子量比較接近的物質分開，這種分離叫分級分離

分級分離一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質的凝膠。在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內部，但由分級分離于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。第四十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五凝膠層析的基本操作平衡溶液的流速應低于層析時需要的流速注意凝膠的斷層和氣泡層析柱平衡操作壓控制平衡和洗脫時應維持流速恒定第四十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五上柱樣品溶液的體積根據分離要求來確定：進樣體積進行組別分離時，樣品溶液最大可為柱體積的10%進行分級分離時，樣品溶液的體積要小，使樣品層盡可能窄，這樣洗脫出的峰形好第四十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五3.親和層析親和層析的基本概念親和層析載體的性質與選擇親和層析配基的性質與選擇親和層析的基本操作第四十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五親和層析的基本概念

親和層析是利用待分離物質與其特異性配體之間特異性的親和力進行分離的一類特殊的層析技術，它有如下特點：純化過程簡單、迅速，且分離效率高特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子親和層析的基本特點純化倍數大，產物純度高必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件因此應用范圍受到一定的限制第四十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五抗原與抗體DNA與互補DNA或RNA（cDNA、mRNA)酶與其底物、競爭性抑制劑、輔酶因子激素或藥物與其受體具有特異性親和作用的生物分子維生素于其特異性結合蛋白糖蛋白與其相應的植物凝集素第四十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑當含有混合組份的樣品（流動相）通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質，才能被固定相吸附結親和層析的基本原理合，其它沒有親和力的無關組份就隨流動相流出然后改變流動相成份，將結合的親和物洗脫下來第四十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五親和層析（affiuitychromatography）

應用分離純化酶、抗原、抗體分離純化核酸研究酶的結構與功能+待純化分子配體a.理論依據：待純化分子和配體間具有親和性+基質b.活性基質與配體結合產生親和吸附劑++雜質c.待純化分子與親和吸附劑結合，與雜質分離+d.偶聯復合物經解離后，得到純的待純化分子原理：基質纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、

sepharose、sephadex第四十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五親和層析原理示意圖

蛋白質混合物配體與配體結合的蛋白質加入的可溶性配基專一性結合蛋白質沒有結合的蛋白質非專一性結合蛋白質蛋白質濃度洗脫體積與配體專一性結合蛋白質加入配基基質第四十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五親和層析載體的性質與選擇具有多孔的立體網狀結構，能使被親和吸附的大分子自由通過具有良好機械性能的均勻珠狀顆粒，具有良好的流速親和層析載體的選擇具有惰性，盡量減少非專一性吸附具有相當量的易活化的基團，在溫和的條件下能與配基共價合偶聯在偶聯、吸附和洗脫時，有較好的物理化學穩(wěn)定性第五十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五纖維素葡聚糖凝膠常用的親和層析載體瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠其它新型載體

第五十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五純化對象和配基之間必須有較強的親和力但親和力太高也是有害的，因為在解離配基復合物時所需的親和層析配基的選擇條件就要強烈，這樣可能使生物分子變性配基必須具有適當的化學基團，這種基團不參與配基與生物分子之間特異結合，但可用于和載體相連，同時又不影響配基與生物分子之間的親和力第五十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五酸酐法N-取代羥基琥珀酰亞胺法配基的偶聯疊氮化作用還原性烷基化合物（西夫堿）的形成第五十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五親和層析的基本操作通常采用改變pH、離子強度、離子種類或者溫度等，降低其親和力。非專一性洗脫化的配基對相應的生物大分子的親和力降低非專一性洗脫劑的作用并不是使被吸附的生物大分子的構象發(fā)生變化，而是洗脫劑中的某一組分與固定配基形成復合物，使固定第五十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五使用特異的配基作為洗脫劑溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標產物的競爭性結合來洗專一性洗脫使用含有與親和配基或目標產物具有親和作用的小分子化合物脫目標產物第五十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五親和雙方吸附能力很強，可以用專一的化學方法裂解配基與載特殊性洗脫體的連接鍵，獲得的配基-蛋白絡合物后，再除去配基。第五十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五4.膜分離膜分離的基本原理分離膜的主要性能影響膜分離的因素第五十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五膜分離的基本原理膜分離是利用膜的選擇性，以膜的兩側存在一定量的能量差作為膜分離的基本定義推動力，由于溶液中各組分透過膜的遷移速率不同而實現的分離。依據濾膜孔徑和物質粒子的大小而達到物質分離的目的第五十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五分離效率高膜分離的特點不涉及相變，能耗低，運行成本低膜分離為單純物理變化，無二次污染第五十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五分離膜的選擇通透性：是物質分離的第一機制膜分離過程的重要參數膜分離過程的推動力：靜壓力差、濃度差、電位差物質通過分離膜的速度：是物質分離的第二機制第六十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五根據分離膜膜內平均孔徑、推動力和傳遞機制不同，膜分離可膜分離的主要類型反滲透（ReverseosmosisRO）透析（DialysisDS）分成下列幾類：超濾（UitrfiltrationUF）微濾（MicrofitrationMF）電滲析（ElectrodialysisEI）第六十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五透析半透膜袋蛋白質溶液透析液磁棒磁力攪拌器

透析是利用蛋白質等大分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和其它小分子物質如無機鹽單糖等分開。常用的半透膜：

玻璃紙（賽璐玢紙，cellophanepaper）

火綿紙（賽璐玎紙,celloidinpaper）

其他改型纖維素材料第六十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五按照分子大小進行分離。分離取決于透析袋截留的分子量。透析液濃縮的蛋白混合樣品透析袋開始透析處于平衡狀態(tài)第六十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五反滲透（ReverseosmosisRO）

反滲透其主要原理是在高于溶液滲透壓的作用下，使其它物質溶解鹽類、膠體、微生物、熱源、有機物等，因而主要用于海水、不能透過半透膜，而將這些物質與水分離開來，有效地去除水中的苦咸水淡化和產純水制備等方面第六十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五超濾（UitrfiltrationUF）

超濾是一種根據高分子溶質之間或高分子與小分子溶質之間相相應的截留分子量范圍從500到100萬左右。對分子質量的差別進行分離的方法。篩分孔徑范圍1nm-0.1mm，第六十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五超濾第六十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五分離膜的基本性能

分離膜是膜分離技術的核心，分離膜的性能主要包括分離透過性、耐酸堿性、抗氧化性、抗微生物降解性、親水性、疏水性、電性能和化學物理性能兩部分。其中，化學物理性能主要涉及到耐熱性能、毒性、機械強度等。膜的化學物理性能第六十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五微濾膜 0.025-14mm反滲透膜 0.0001-0.001mm超濾膜 0.001-0.02mm納米過濾膜 平均孔徑2nm膜的分類按膜的孔徑大小分類：第六十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五對稱性膜 膜截面上的孔道結構均勻不對稱性膜 由表面活性層（超薄層）和惰性層（支撐層）構成按膜的結構分類： 傳質阻力大，透過通量低，易污染、難清洗 傳質阻力小，透過通量高，被廣泛使用第六十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五天然高分子膜醋酸纖維素、硝酸纖維素、再生纖維素合成聚合物膜聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物按膜的材料分類：無機材料膜陶瓷、微孔玻璃、不銹鋼、碳素第七十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五影響膜分離的因素影響膜分離效率的主要因素是膜的污染，其表現形式是：溶質在膜孔內吸附造成膜污染的主要原因是：蛋白質在不同pH條件下所帶電荷對膜電荷的相互作用無機鹽通過形成復合物、改變溶液離子強度等機制污染膜溶質在膜表面沉淀或結晶膜分離過程中體系的粘度增大會污染膜第七十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

三、基因重組蛋白包涵體的分離和復性第七十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五外源基因在大腸桿菌中的表達形式位于細胞質細胞周質細胞外表達產物形式包涵體蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白第七十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五細胞質中表達:

外源基因在大腸桿菌寄主細胞質中高效表達時，常會發(fā)生一種特殊的生理現象，形成包涵體。包涵體：存在于細胞質中的一種由不可溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構物。第七十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體表達形式的優(yōu)點

在一定程度上保持表達產物的結構穩(wěn)定

能夠避免細胞內蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集

簡化外源基因表達產物的分離操作

包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白。第七十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體表達形式的缺點

以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能得到有正確空間構象的目標蛋白。

體外復性蛋白質的成功率相當低，一般不超過30%

復性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。第七十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體直徑約0.5-1μm，具有很高的密度（約1.3mg/ml），相差顯微鏡下有折光性，呈非水溶性，只溶于高濃度變性劑如尿素、鹽酸胍等。第七十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體加工流程離心去除細胞碎片（膜蛋白和脂類等）機械破碎法包涵體提取如何對包涵體蛋白進行高效體外復性以獲得活性產品是生物工程產業(yè)化經常面臨的一個難題第七十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體的洗滌為除去包涵體上粘附的雜質，應用洗滌液洗滌包涵體沉淀常用去污劑TritonX-l00或脫氧膽酸鈉和低濃度變性劑（如2mol/L尿素或鹽酸胍等，洗滌以除去脂類和膜蛋白。如：50mMTris-HCl，pH7.0-8.5，2M尿素，1mMEDTA第七十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五包涵體的溶解大多數在pH8的條件下，用強變性劑如8mol/L尿素、6mol/L鹽酸胍，打斷包涵體蛋白質分子內和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展對于含有S-S的蛋白質，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內的非活性二硫鍵→為將包涵體充分溶解，需加入還原劑（如二硫蘇糖醇DTT、GSH、β－巰基乙醇β-ME）打開蛋白質中所有二硫鍵，一般是50-100mMβ-ME或DTT（對于目標蛋白沒有二硫鍵的有時也應使用還原劑，因為含S-S的雜蛋白會影響包涵體的溶解）同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子，防止已經處于還原狀態(tài)的SH-與之發(fā)生氧化反應。包涵體溶解后，蛋白質成為失去了生物學活性伸展肽鏈

第八十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五蛋白質復性機理蛋白質復性過程中，涉及兩種疏水相互作用：一是分子內的疏水相互作用→促使蛋白質正確折疊二是肽鏈分子間的疏水相互作用→導致蛋白質分子間聚集，形成寡聚體和多聚體→再進一步聚集形成沉淀→兩者互相競爭，影響蛋白質復性收率?！鷱托赃^程中，抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集，是提高復性收率的關鍵。伸展態(tài)U中間體I局部肽段先由氫鍵形成一些二級結構構象單元，如α螺旋、β折疊、β轉角等聚集體A天然態(tài)N快慢第八十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五一般說來，在優(yōu)化的條件下，大多數蛋白質體外復性效率在20%左右

第八十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五復性常用方法1.稀釋復性：直接加入水或復性緩沖液，缺點是體積增加較大，后續(xù)處理困難。第八十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

2.透析復性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，速度慢，不適合大規(guī)模操作。

3.超濾復性：選擇合適載留分子量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質通不過。缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性（蛋白聚集于膜上）。第八十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五4.色譜復性：兼具分離。4.1凝膠過濾復性：該法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對較慢，對有些蛋白質的復性有利。第八十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五4.2吸附型層析復性：原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣并吸附在凝膠介質上，然后用清洗緩沖液洗掉未吸附的變性劑和雜蛋白，最后用復性緩沖液將吸附的蛋白洗脫下來，在洗脫過程中完成復性。第八十六頁，共九十七頁，編輯于2