第六章核酸的研究技術(shù)

第六章核酸的研究技術(shù)演示文稿本文檔共102頁；當前第1頁；編輯于星期六\12點7分（優(yōu)選）第六章核酸的研究技術(shù)本文檔共102頁；當前第2頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第3頁；編輯于星期六\12點7分解鏈溫度（融解溫度，Tm）

(meltingtemperature)：

使50%的DNA發(fā)生變性時的環(huán)境溫度。

DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈是在一個相當窄的溫度內(nèi)完成的。本文檔共102頁；當前第4頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第5頁；編輯于星期六\12點7分增色效應(yīng)：

DNA變性后對260nm紫外光收增加的現(xiàn)象。本文檔共102頁；當前第6頁；編輯于星期六\12點7分DNA的復(fù)性（renaturation)：

在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可再恢復(fù)成天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。

熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱為退火(annealing)。本文檔共102頁；當前第7頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第8頁；編輯于星期六\12點7分減色效應(yīng)：變性DNA復(fù)性后對260nm紫外光吸收減少的現(xiàn)象。本文檔共102頁；當前第9頁；編輯于星期六\12點7分1.常用的變性方法：

①熱變性

②酸堿變性

③化學試劑變性

本文檔共102頁；當前第10頁；編輯于星期六\12點7分2.影響復(fù)性的因素

①序列簡單的分子復(fù)性快，如poly(dT)和poly(dA)識別快②DNA片段愈大，擴散速度愈低，復(fù)性慢③離子強度↑→有利于復(fù)性④DNA濃度↑→復(fù)性↑

Tm值的估算①<20bpTm=4（G+C）+2（A+T）②>20bpTm=69.3+0.41(G+C)%③ Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61×（甲酰胺%）

本文檔共102頁；當前第11頁；編輯于星期六\12點7分核酸雜交：不同來源的兩條核酸單鏈由于具有互補序列，在一起復(fù)性時，互補序列配對，形成雜化分子。++本文檔共102頁；當前第12頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第13頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第14頁；編輯于星期六\12點7分二、影響雜交的因素

1.核酸分子的濃度和長度

2.溫度：比Tm低25℃~30℃較適宜3.離子強度：離子強度↑→雜交反應(yīng)率↑

本文檔共102頁；當前第15頁；編輯于星期六\12點7分

4.雜交液中的甲酰胺

甲酰胺能降低核酸雜交的Tm，含30%—50%甲酰胺的雜交溶液溫度能降低到30—42℃。使用甲酰胺的優(yōu)點：

①低溫下探針更穩(wěn)定；②能更好地保留非共價結(jié)合的核酸。本文檔共102頁；當前第16頁；編輯于星期六\12點7分注意：①待測核酸順序與探針順序同源性高的雜交，用水溶液時取68℃，用50%甲酰胺溶液時取40℃。②待測核酸順序與探針同源性不高時，以50%甲酰胺溶液在35—40℃雜交。本文檔共102頁；當前第17頁；編輯于星期六\12點7分5.核酸分子的復(fù)雜性直接影響復(fù)性幾率。6.非特異性雜交反應(yīng)：在雜交前將非特異性位點進行封閉，以減少對探針的非特異性吸附作用。常用封閉物：①變性非特異DNA：鮭魚精子DNA， 小牛胸腺DNA②高分子化合物：Denhardt溶液 脫脂奶粉

本文檔共102頁；當前第18頁；編輯于星期六\12點7分三、核酸探針

（一）探針的選擇原則

1.高度的特異性

2.制備探針的難易性和檢測手段的靈敏法

（二）探針的種類

本文檔共102頁；當前第19頁；編輯于星期六\12點7分1.基因組DNA探針從基因組DNA文庫中選取某一基因片段

↓

與載體連接（質(zhì)粒、噬菌體）↓克隆(PCR擴增)↓酶切優(yōu)點：①無性繁殖、制備方法簡單；②不易降解（與RNA比較）；③標記方法成熟。

本文檔共102頁；當前第20頁；編輯于星期六\12點7分2.cDNA探針（complementaryDNA）

↓S1核酸酶切平兩端優(yōu)點：不含內(nèi)含子及高度重復(fù)序列但不易獲得↓載體連接↓克隆通過逆轉(zhuǎn)錄↓雙鏈cDNA加接頭 ↓限制酶粘性末端本文檔共102頁；當前第21頁；編輯于星期六\12點7分3.RNA探針：檢測DNA和mRNA

優(yōu)點：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性 雜交較少,未雜交探針可用RNase 降解，減少本底的干擾。

缺點：易降解，標記方法復(fù)雜

本文檔共102頁；當前第22頁；編輯于星期六\12點7分4.寡核苷酸探針

優(yōu)點：①可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列； ②探針短,序列復(fù)雜性低,分子量小， 因此雜交時間短; ③長度只有10—50bp，該識別序 列內(nèi)1個堿基的變化可明顯降低雜 交Tm值。 ④可大量合成，價格低，能夠用酶 學或 化學方法進行非放射性標記。

本文檔共102頁；當前第23頁；編輯于星期六\12點7分（三）探針設(shè)計原則：

①長度：10~50bp②堿基成分:G+C含量為40%~60%

③探針分子內(nèi)無互補序列。④避免同一堿基重復(fù)出現(xiàn)。⑤一旦選定某一序列后，尚需與已知的各種基因序列進行同源性比較，與非靶區(qū)域的同源性不應(yīng)超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基同源。本文檔共102頁；當前第24頁；編輯于星期六\12點7分（四）探針標記物的選擇

理想的標記物：

①具有高度的靈敏性②與探針結(jié)合后，不影響雜交及探針的主要理化特性③檢測方法高靈敏性、高特異性，假陽性率低，環(huán)境污染少，價格低廉；④若用酶促方法標記，應(yīng)對Km影響不大本文檔共102頁；當前第25頁；編輯于星期六\12點7分常用的放射性標記物

常用探記探針的同位素：

32P、3H、35S、14C、125I、131I本文檔共102頁；當前第26頁；編輯于星期六\12點7分2.特性：

①檢測特異性強；②靈敏度高；③對酶促反應(yīng)無任何影響，也不影響堿基配對的特異性和穩(wěn)定性；④易造成放射性污染；⑤半衰期短的同位素應(yīng)用受到限制，隨用隨標記，立即使用，不能長時間存放。本文檔共102頁；當前第27頁；編輯于星期六\12點7分3.探針標記的方法

①缺口平移法（nicktranslation）實質(zhì)：用[α-32P]dNTP取代原來DNA鏈中不帶同位素的同種核苷酸，生成的兩條鏈均被同位素標記。本文檔共102頁；當前第28頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第29頁；編輯于星期六\12點7分②隨機引物法（randompriming）人工合成的6~8個核苷酸長的各種不同排列順序的混合物，它們可以隨機地互補到DNA探針的某一處，作為引物，在Klenow片段作用下，合成與探針DNA互補的DNA鏈，當在反應(yīng)液中加入[α-32P]dATP時，即可形成放射性同位素標記的DNA探針，但探針DNA序列是長短不等的。優(yōu)點：比活度高，結(jié)果穩(wěn)定本文檔共102頁；當前第30頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第31頁；編輯于星期六\12點7分③用T4多核苷酸激酶標記DNA5ˊ末端

5ˊ-pCpGpApCpG-3ˊ

堿性磷酸酶(AKP）

5ˊ-HOCpGpApCpG-3ˊ

[γ-32P]ATPT4噬菌體多核苷酸激酶（PNK）

5ˊ-32PCpGpApCpG-3ˊ

本文檔共102頁；當前第32頁；編輯于星期六\12點7分④Klenow片段快速標記DNA探針末端

用枯草桿菌蛋白酶切割可得兩條多肽鏈

N——C5ˊ→3ˊ外切酶

3ˊ→5ˊ外切酶

5ˊ→3ˊ聚合酶

小片段(36000) Klenow片段（67000）

3′—CTTAAG—5′5′—GAATTC—3′EcoRⅠ

5′——G AATTC——3′

3′——CTTAA G——5′

Klenow,dNTP,[α-32P]dATP

5ˊ——GAATTAATTC——3ˊ

3ˊ——CTTAATTAAG——5

本文檔共102頁；當前第33頁；編輯于星期六\12點7分常用的非放射性標記

優(yōu)點：無環(huán)境污染，可較長時間貯存方法：1.酶標記法

2.化學標記法要求：標記物應(yīng)具有耐熱、對組織細胞無特異親和性、分子量小，對探針雜交無影響或影響甚小，不影響DNA三維空間構(gòu)象的形成。常用的標記物：生物素（biotin）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（photobiotin）、補骨脂素、2-乙酰氨基芴（2-acetylominofluorene）本文檔共102頁；當前第34頁；編輯于星期六\12點7分1.生物素標記核酸探針Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。2.地高辛（Dig）標記核酸探針本文檔共102頁；當前第35頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第36頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第37頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第38頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第39頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第40頁；編輯于星期六\12點7分四、核酸分子雜交技術(shù)

（一）類型：根據(jù)反應(yīng)環(huán)境分為1.固相雜交：將需要雜交的一條核酸鏈先固定 在固體支持物上，另一條核酸 鏈游離在液體中。2.液相雜交：參與反應(yīng)的兩條核酸鏈都游 離在液體中。本文檔共102頁；當前第41頁；編輯于星期六\12點7分（二）固體支持物種類硝酸纖維素膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠、微孔板等。選擇原則：①具有較強的結(jié)合核酸的能力；②與核酸的結(jié)合比較穩(wěn)定③盡量少的非特異性吸附本文檔共102頁；當前第42頁；編輯于星期六\12點7分（三）常用固相雜交類型Southern印跡雜交、Northern印跡雜、菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、組織原位雜交、夾心雜交等。本文檔共102頁；當前第43頁；編輯于星期六\12點7分1.Southern印跡雜交主要步驟：本文檔共102頁；當前第44頁；編輯于星期六\12點7分純化的待測DNA樣品

瓊脂糖凝膠電泳分離酶切DNA片段

凝膠上DNA變性

中和

DNA轉(zhuǎn)印至NC膜

預(yù)雜交

限制性內(nèi)切酶酶切后（EDTA，65℃滅活限制酶）

變性液（堿變性）

Tris緩沖液

高鹽下

烘干、固定

雜交

放射自顯影

結(jié)果分析

本文檔共102頁；當前第45頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第46頁；編輯于星期六\12點7分southern印跡載體凝膠吸水紙緩沖液濾紙固定到載體本文檔共102頁；當前第47頁；編輯于星期六\12點7分2.Northern印跡雜交是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到NC膜上的方法。與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Westernblotting。3.斑點雜交（dotblot）(線狀圓形)本文檔共102頁；當前第48頁；編輯于星期六\12點7分4.原位雜交（insituhybridization）直接用探針與細胞或組織切片中的核酸雜交。應(yīng)用：1）觀察基因在組織中的表達

2）確定基因在染色體中的定位本文檔共102頁；當前第49頁；編輯于星期六\12點7分5.菌落原位雜交（colonysituhybridization）將細菌從平板轉(zhuǎn)移到NC膜上

裂解細菌釋出DNA

烘干

雜交

本文檔共102頁；當前第50頁；編輯于星期六\12點7分（四）核酸雜交的應(yīng)用在醫(yī)學研究與實踐中，核酸雜交主要用于基因診斷。

1、遺傳病的診斷：例：β-地中海性貧血的檢驗

2、病原體的鑒定：例：結(jié)合桿菌的快速鑒定3、癌基因點突變分析4、用于骨髓移植與器官移植時的組織配型及親子鑒定本文檔共102頁；當前第51頁；編輯于星期六\12點7分附：蛋白免疫雜交（一）蛋白質(zhì)的免疫印跡（western)場所：硝酸纖維素膜待檢分子：蛋白探針：抗體雜交的方式：經(jīng)電泳分離不同的蛋白，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用特定的抗體與蛋白雜交，檢測特定的蛋白。本文檔共102頁；當前第52頁；編輯于星期六\12點7分（二）所用抗體1、一抗：針對待測分子的抗體2、二抗：針對一抗的抗體，標記有放射性同位素或生物素本文檔共102頁；當前第53頁；編輯于星期六\12點7分（三）操作過程蛋白的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同的蛋白質(zhì)本文檔共102頁；當前第54頁；編輯于星期六\12點7分蛋白印跡封閉+陽極-陰極多孔墊片濾紙凝膠載體本文檔共102頁；當前第55頁；編輯于星期六\12點7分雜交（一抗與特定蛋白結(jié)合）漂洗去除多余的一抗二抗與一抗結(jié)合漂洗去多余的二抗結(jié)果檢測本文檔共102頁；當前第56頁；編輯于星期六\12點7分第二節(jié)核酸的測序技術(shù)本文檔共102頁；當前第57頁；編輯于星期六\12點7分一、Sanger雙脫氧終止法

(chain-terminatormethod)本文檔共102頁；當前第58頁；編輯于星期六\12點7分原理

在模板指導(dǎo)下，聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延長，合成出新的互補的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA的核苷酸序列。本文檔共102頁；當前第59頁；編輯于星期六\12點7分Sanger雙脫氧鏈終止法本文檔共102頁；當前第60頁；編輯于星期六\12點7分1.雙脫氧終止法測序反應(yīng)體系包括：DNA聚合酶單鏈DNA模板帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物Mg2+4種dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP)4種ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)本文檔共102頁；當前第61頁；編輯于星期六\12點7分2.Sanger法DNA測序的試劑①引物：通常由20-23個堿基構(gòu)成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)②模板③DNA聚合酶④2′，3′-雙脫氧核苷三磷酸（2′,3′-dideoxynucleosidetriphosphate,ddNTP

）⑤dNTP本文檔共102頁；當前第62頁；編輯于星期六\12點7分3.測序反應(yīng)的種類①引物標記法(Dyeprimerreactions)②終止物標記法(Dyeterminatorreactions)本文檔共102頁；當前第63頁；編輯于星期六\12點7分Dyeprimerreactions-fluorescentdye(label)ontheprimer,onespecificdyeforeachnucleotidetobeidentified(A,C.G,T)-fourseparatereactionscoupleeachspecificprimerwiththecorrespondingddNTP本文檔共102頁；當前第64頁；編輯于星期六\12點7分Thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide(noticetheHatomattachedtothe3'carbon).AlsodepictedinthisfigurearetheingredientsforaSangerreaction.Noticethedifferentlengthsoflabeledstrandsproducedinthisreaction.

本文檔共102頁；當前第65頁；編輯于星期六\12點7分Thisfigureisarepresentationofanacrylamidesequencinggel.NoticethatthesequenceofthestrandofDNAcomplementarytothesequencedstrandis5'to3'ACGCCCGAGTAGCCCAGATTwhilethesequenceofthesequencedstrand,5'to3',isAATCTGGGCTACTCGGGCGT

本文檔共102頁；當前第66頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第67頁；編輯于星期六\12點7分Dyeterminatorreactions-theprimerisnotlabeledwithadye-thedyeisattachedtothedideoxynucleotide,sowheneveraddNTPisaddedbythepolymerase,thefragmentislabeledaccordingtotheddNTPattheend-sincelabelingoccurswiththeadditionoftheddNTP,onlyonereactionpertemplateisneeded本文檔共102頁；當前第68頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第69頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第70頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第71頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第72頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第73頁；編輯于星期六\12點7分二、Maxam-Gilbert化學修飾法

(chemicalcleavagemethod)一、原理AsegmentofDNAislabeledatoneendwith32P.ThelabeledDNAisdividedintofoursamplesandeachsampleistreatedwithachemicalthatspecificallydestroysoneortwoofthefourbasesintheDNA.TheconditionsofthereactionarecontrolledsothatonlyafewsitesarenickedinanyoneDNAmolecule.Whenthesenickedmoleculesaretreatedwithpiperidine,theDNAbackbonesisbrokenatthesiteatwhichthebasehadbeendestroyed.Thisgeneratesaseriesoflabeledfragments,thelengthofwhichdependonthedistanceofthedestroyedbasefromthelabeledend.ThesetsoflabeledfragmentsobtainedfromeachofthefourreactionsarerunsidebysideonanacrylamidegelthatseparatesDNAfragmentsaccordingtosize.本文檔共102頁；當前第74頁；編輯于星期六\12點7分原理

一個末端標記的DNA片段在4組互相獨立的化學反應(yīng)中分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異的針對某一種或某一類堿基。因此生成4種放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。本文檔共102頁；當前第75頁；編輯于星期六\12點7分基本步驟

第一步，對特定堿基（或特定類型的堿基）進行化學修飾；第二步，修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基5和3的磷酸二酯鍵斷裂；第三步，比較G、A+G、C+T、C和A>C各個泳道，可從測序凝膠的放射自顯影片上讀取DNA序列。本文檔共102頁；當前第76頁；編輯于星期六\12點7分DNA化學裂解反應(yīng)體系反應(yīng)體系修飾試劑修飾反應(yīng)鏈斷裂試劑斷裂點G硫酸二甲酯（DMS）G甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G和AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C和TC肼（加鹽）C六氫吡啶C本文檔共102頁；當前第77頁；編輯于星期六\12點7分Maxam-Gilbert化學修飾法本文檔共102頁；當前第78頁；編輯于星期六\12點7分特點重現(xiàn)性好，所用試劑簡單，易于掌握；所測長度比Sanger法短一些，對放射性標記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果較好；序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所生成的拷貝；可對合成的寡核苷酸進行測序，用以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，通過化學保護及修飾干擾實驗來研究DNA的二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)-DNA相互作用。本文檔共102頁；當前第79頁；編輯于星期六\12點7分無需延伸反應(yīng)及克隆更適于含有稀有堿基或GC含量高及短鏈寡核苷酸的測序，可雙向標記并測序。比較繁瑣費時，過長序列有困難。

本文檔共102頁；當前第80頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第81頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第82頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第83頁；編輯于星期六\12點7分三、DNA測序的自動化和大規(guī)模測序①

文庫構(gòu)建②轉(zhuǎn)化③培養(yǎng)④模板制備⑤電泳檢測模板⑥測序反應(yīng)⑦毛細管電泳測序⑧數(shù)據(jù)收集處理本文檔共102頁；當前第84頁；編輯于星期六\12點7分本文檔共102頁；當前第85頁；編輯于星期六\12點7分

第三節(jié)PCR技術(shù)

本文檔共102頁；當前第86頁；編輯于星期六\12點7分

多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)

本文檔共102頁；當前第87頁；編輯于星期六\12點7分基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增本文檔共102頁；當前第88頁；編輯于星期六\12點7分PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。本文檔共102頁；當前第89頁；編輯于星期六\12點7分KaryB.Mullis（1944－）本文檔共102頁；當前第90頁；編輯于星期六\12點7分三篇重要論文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Sc