第十一章 動物細胞培養(yǎng)基礎知識

第十一章動物細胞培養(yǎng)基礎知識第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五主要內容實驗室設置常用器具的清洗消毒方法動物細胞培養(yǎng)用液第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五一、實驗室設置基本實驗室：準備室+接種室+培養(yǎng)室輔助實驗室：細胞學實驗室+生化分析室第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗（1）玻璃器材：初次使用的玻璃器皿：洗滌劑/肥皂水洗滌1~5%HCl浸泡過夜蒸餾水洗2~3次使用過的玻璃器皿立即浸入水中待洗

一般玻璃儀器：肥皂水/洗滌劑洗滌蒸餾水洗滌2~3次

量器：鉻酸洗液浸泡4~6小時蒸餾水洗滌2~3次第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗（2）橡膠器材初次使用：0.5mol/LNaOH15min0.5mol/LHCl15min自來水煮沸蒸餾水煮沸20min用過的橡膠制品：同玻璃器材的清洗第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、常用器具的清洗消毒方法1、清洗（3）塑料器皿2%NaOH浸泡過夜2~5%HCl浸泡30min蒸餾水洗（4）金屬器皿洗衣粉洗滌蒸餾水洗酒精棉球擦拭晾干第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、常用器具的清洗消毒方法2、消毒物理：熱力滅菌、電離輻射、紫外滅菌化學：重金屬鹽、氧化劑、表面活性劑生物：抗生素第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、動物細胞培養(yǎng)用液培養(yǎng)基平衡鹽其他（雜用液）第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基1、組成成分糖：葡萄糖無機離子與微量元素：如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩氨基酸：12種必需氨基酸，精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸。Ｌ型。第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基1、組成成分：維生素：至少8種，生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素Ｂ12。促生長因子及激素：如胰島素（insulin），它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基2、pH：大多數(shù)細胞的適宜pH為7.2～7.4,一般不能超過6.8~7.6。造成培養(yǎng)基pH波動的主要物質是細胞代謝產生的CO2,在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結合產生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基2、pH：調節(jié)：使用NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)（合成培養(yǎng)基中，或Hepes），再通過穩(wěn)定調節(jié)培養(yǎng)箱中CO2

氣體的濃度（5%）,使之與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。NaHCO3

＋H2O←→Na++HO-+H2O+CO2↑當[CO2]能夠保持相對穩(wěn)定時，上述反應就可達到平衡，[OH－]也相對恒定，即pH相對恒定。第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基3、分類天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：主要指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術建立的早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)物質，滲透壓、pH等也與體內環(huán)境相似，但制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前仍然廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清（serum），另外組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養(yǎng)某些特殊細胞時也不可缺少。第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基血清的種類：主要是牛血清，在培養(yǎng)某些特殊細胞時也用人血清、馬血清等。牛血清還分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清。一般使用的為小牛血清，小牛血清取自出生10～30天的小牛。第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基血清的質量標準：血清質量的鑒定一般包括理化性質：如滲透壓、pH，球蛋白、血紅蛋白含量越低血清質量越高。微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等促生長效果檢測：克隆形成率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)測定法。第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基血清的使用與儲存：大部分血清在使用之前必須經過滅活處理，即56℃放置30分鐘。（滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產生細胞毒作用。滅活也會損失一些對細胞有利的成分如生長因子，因此也有人提出血清不經滅活直接用于培養(yǎng)）儲存條件：血清一般儲存于-20℃，同時應避免反復凍融?？蓽缁詈蠓盅b，使用時4℃融化。第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（1）、天然培養(yǎng)基血清使用的缺點：批次差異。鼠尾膠原：它的主要作用是促進細胞的貼壁，特別是對上皮類細胞。組織浸出液：Hank’s浸30min

第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基：最初研制合成培養(yǎng)基，就希望使其完全替代天然培養(yǎng)基，但結果卻沒有象人們所預期的那樣，許多合成培養(yǎng)基都只能使體外培養(yǎng)細胞短暫生存，只有在添加了少量天然培養(yǎng)基（血清）之后，細胞才能在其中長期生長繁殖。

這類合成培養(yǎng)基稱為“基本培養(yǎng)基”或“通用培養(yǎng)基”，在添加了一定比例的血清之后，稱之為“完全培養(yǎng)基”。第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基：常用基本培養(yǎng)基199培養(yǎng)基低限量基礎培養(yǎng)基（minimumessentialmedia,MEM）DMEM(Dulbecco’smodifiedEaglemedium)IMDM(Iscove’smodifiedDulbecco’smedium)：適合于細胞密度較低、生長較困難的情況RPMI1640第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基②無血清培養(yǎng)基雖然基礎培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)實驗的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，又如測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質（抗體、生長因子）的能力。無血清培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)液

+添加組分。第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（2）、合成培養(yǎng)基②無血清培養(yǎng)基添加組分包括以下幾大類物質：促貼壁物質：一般是細胞外基質，如纖連蛋白（FN）、層粘連蛋白(LN)等。

促生長因子及激素酶抑制劑：最常用的是大豆胰酶抑制劑。結合蛋白和轉運蛋白：常見的有轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。微量元素：硒是最常見的第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（一）、培養(yǎng)基（3）、無蛋白培養(yǎng)基(proteinfreemedium，PFM)

不含動物蛋白的培養(yǎng)基。添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。（4）、限定化學成分培養(yǎng)基(CDM)：是指培養(yǎng)基中的所有成分都是明確的，它不含有動物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用一些已知結構與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（二）、平衡鹽溶液平衡鹽溶液：（balancedsaltsolution,BSS）主要由無機鹽、葡萄糖組成。作用：具有維持滲透壓，調控酸、堿平衡的作用提供細胞生存所需的能量和無機離子成分用于洗滌組織、細胞配制各種培養(yǎng)用液第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（二）、平衡鹽溶液幾種常用的平衡鹽溶液：RingerPBSTyrodeEarleHank’sD-Hank’sDulbecco第二十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（三）、其他培養(yǎng)用液1、消化液胰酶溶液（0.1%~0.5，pH8.0）膠原酶溶液（0.1～0.3mg／L或200U／mL，pH6.5）EDTA溶液（0.02%）上述溶液可混合使用第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（三）、其他培養(yǎng)用液2、pH調整液NaHCO3溶液（常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液）HEPES液（HEPES是一種弱酸，中文名稱是羥乙基哌嗪乙硫磺酸，使用的終濃度為0.01～0.05mol/L；可維持pH在7.0左右）。第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（三）、其他培養(yǎng)用液3、谷氨酰胺補充液谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，是合成培養(yǎng)基的重要成分。由于谷氨酰胺容易降解，所以都是在使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，配制時應加溫至30℃，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于-20℃。第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（三）、其他培養(yǎng)用液4、抗生素液常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。青霉素使用的終濃度為100000U/L，鏈霉素使用的終濃度為0.1g/L。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止按現(xiàn)代的觀念，凡是混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應該視為污染。根據這一概念，組織培養(yǎng)污染物應包括生物（真菌、細菌、病毒和支原體）化學物質（影響細胞生存、非細胞所需的化學成分）細胞（非同種的其他細胞）。其中以微生物最為多見。另外，隨著使用細胞種類增多，不同細胞交叉污染，尤其是Hela細胞的污染也時有發(fā)生，從而造成細胞不純。第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止一、污染途徑1空氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。因此，培養(yǎng)設施不能設在通風場所。無菌操作應在凈化臺內進行，工作時要帶口罩，以免因講話、咳嗽等使外界污染進入操作面，造成污染。2器材：各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導致污染，另外需要對培養(yǎng)箱進行定期消毒，防止形成污染3操作：實驗操作無菌觀念不強，培養(yǎng)兩種細胞以上時，交叉使用吸管或培養(yǎng)液、瓶等有可能導致細胞交叉污染。

4血清：有些血清在生產時就已經被支原體或病毒等污染，變成了污染。5組織樣本第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止污染對培養(yǎng)細胞的影響培養(yǎng)細胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。細胞污染早期或污染程度較輕時，如果能及時去除污染物，部分細胞有可能恢復。污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細胞生長緩慢，分類象減少，細胞變得粗糙，輪廓增強細胞漿出現(xiàn)顆粒；污染較嚴重，細胞增值停止，分裂象消失，細胞質中出現(xiàn)大量堆積物，細胞變圓、脫壁。第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止細菌污染對培養(yǎng)細胞的影響及污染物的檢測常見的污染細菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。檢測：取10ml細胞懸液離心1000轉5分鐘，沉淀中加入無抗生素培養(yǎng)液2ml，將細胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當污染細菌時，培養(yǎng)系統(tǒng)中產生大量細菌，幾個小時后，增殖的細菌就可以導致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點狀的細菌顆粒，原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細菌甚至可以覆蓋細胞，對細胞的生存構成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預防細菌污染有效。第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止真菌污染對細胞的影響及污染物的檢測微生物污染中以真菌最多，真菌污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細胞周邊和細胞之間生長。真菌生長迅速，能在短時間內抑制細胞生長、產生有毒物質殺死細胞?？拐婢苿︻A防和排除真菌污染有效。第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止支原體污染對細胞影響及污染物的檢測

細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題，是細胞培養(yǎng)最常見的、干擾試驗結果的一種污染。研究表明，95％以上是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。支原體污染細胞后，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。第三十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止支原體污染對細胞影響及污染物的檢測支原體最突出的結構特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如β-內酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內酯類及一些氟喹諾酮。第三十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止細胞交叉污染對細胞的影響及污染物的檢測細胞培養(yǎng)中，細胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養(yǎng)中操作時各種細胞同時進行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細胞的生長特性、形態(tài)特征等發(fā)生變化。常用觀察細胞形態(tài)學、分析生長特性和核型、檢測細胞的標記物等方法檢測交叉污染的細胞。第三十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五三、培養(yǎng)物的污染及防止污染的預防:1.器皿準備中的預防：嚴格消毒，做