中醫(yī)藥干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬細胞泡沫化機制研究

中醫(yī)藥干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬細胞泡沫化機制研究本文檔共74頁；當前第1頁；編輯于星期一\11點43分重視對動脈粥樣硬化泡沫化細胞形成的干預(yù)研究中醫(yī)藥干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞泡沫化及其機制研究

本研究成果的臨床應(yīng)用提綱本文檔共74頁；當前第2頁；編輯于星期一\11點43分第一部分重視對動脈粥樣硬化泡沫化細胞形成的干預(yù)研究本文檔共74頁；當前第3頁；編輯于星期一\11點43分背景動脈粥樣硬化（As）心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)國內(nèi)外心腦血管領(lǐng)域探討的熱點和重點本文檔共74頁；當前第4頁；編輯于星期一\11點43分泡沫細胞的生物學特征泡沫細胞是As斑塊內(nèi)特征性病理細胞是As的早期標志在形態(tài)學上，細胞漿內(nèi)脂質(zhì)成分明顯增多，并聚集成滴，鏡下可見胞漿呈泡沫樣改變；細胞內(nèi)總膽固醇增加，且膽固醇酯占總膽固醇的一半以上。

本文檔共74頁；當前第5頁；編輯于星期一\11點43分兩種來源的泡沫細胞As泡沫化細胞單核巨噬細胞泡沫化平滑肌細胞泡沫化As斑塊內(nèi)特征性病理細胞As的早期標志主要產(chǎn)生于As損傷的早期是中后期As病變的主要病理細胞成分本文檔共74頁；當前第6頁；編輯于星期一\11點43分炎癥介質(zhì)與泡沫細胞形成內(nèi)源性炎癥介質(zhì)氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）及外源性炎癥介質(zhì)脂多糖（LPS）均能促進、誘導(dǎo)泡沫細胞的形成。本文檔共74頁；當前第7頁；編輯于星期一\11點43分抑制泡沫細胞形成

是阻止As發(fā)生發(fā)展的重要途徑大量泡沫細胞堆積形成脂質(zhì)條紋乃至脂質(zhì)斑塊；斑塊的進一步破裂、出血及血栓形成會導(dǎo)致各種心腦血管事件的發(fā)生。泡沫細胞形成是As發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。抑制泡沫細胞形成是阻止As發(fā)生及進一步發(fā)展的重要途經(jīng)。對泡沫細胞的早期積極干預(yù)是防治As及相關(guān)心腦血管疾病的重要途徑。本文檔共74頁；當前第8頁；編輯于星期一\11點43分前期研究的回顧脂欣康干預(yù)SD大鼠血管平滑肌

細胞泡沫化的研究本文檔共74頁；當前第9頁；編輯于星期一\11點43分脂欣康膠囊人參皂苷銀杏葉提取物三七總皂苷?；撬岵瓒喾庸πС煞纸M方中醫(yī)藥功效：益氣活血解毒化濁本文檔共74頁；當前第10頁；編輯于星期一\11點43分平滑肌細胞的培養(yǎng)與鑒定VSMC的培養(yǎng)鑒定VSMC萌出10x40

純化VSMC10x40

α-smoothmuscleactin免疫熒光化學染色顯示肌絲10x40本文檔共74頁；當前第11頁；編輯于星期一\11點43分ox-LDL誘導(dǎo)細胞泡沫化及鑒定油紅O染色觀察VSMC內(nèi)脂質(zhì)10x40平滑肌細胞泡沫化平滑肌細胞培養(yǎng)ox-LDL培養(yǎng)48h

油紅O染色后，鏡下可見細胞內(nèi)有大小不等的脂滴，胞漿呈泡沫樣改變，高效液相色譜法檢測，膽固醇酯占總膽固醇的60%以上，表明平滑肌細胞泡沫化成功本文檔共74頁；當前第12頁；編輯于星期一\11點43分分組及制備含藥血清20只200g左右雄性SD大鼠隨機分為5組

脂欣康組

血脂康組

洛伐他汀組

羅格列酮組

生理鹽水組

灌胃5天取血，制備含藥血清本文檔共74頁；當前第13頁；編輯于星期一\11點43分研究分組A脂欣康組B血脂康組C洛伐他汀D羅格列酮組E生理鹽水組F空白對照組——不加含藥血清分別加入含藥血清含藥血清干預(yù)時間——48小時

本文檔共74頁；當前第14頁；編輯于星期一\11點43分對泡沫細胞內(nèi)總膽固醇含量的影響各組平滑肌源性泡沫細胞內(nèi)總膽固醇含量比較高效液相色譜法檢測膽固醇含量（高效液相色譜法

）本文檔共74頁；當前第15頁；編輯于星期一\11點43分對泡沫細胞內(nèi)膽固醇酯含量的影響各組平滑肌源性泡沫細胞內(nèi)膽固醇酯含量比較高效液相色譜法檢測膽固醇酯含量（高效液相色譜法

）本文檔共74頁；當前第16頁；編輯于星期一\11點43分對總膽固醇與膽固醇酯比值的影響空白對照組生理鹽水組洛伐他汀組羅格列酮組血脂康組脂欣康組總膽固醇與膽固醇酯的比值62.75%63.46%47.63%42.25%38.04%37.13%本文檔共74頁；當前第17頁；編輯于星期一\11點43分激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)Ca2+濃度光鏡觀察空白對照組10x40生理鹽水組10x40洛伐他汀組10x40脂欣康組10x40血脂康組10x40羅格列酮組10x40激光共聚焦顯微鏡觀察圖像

本文檔共74頁；當前第18頁；編輯于星期一\11點43分對細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

各組平滑肌源性泡沫化細胞內(nèi)Ca2+濃度的平均熒光強度值

激光共聚焦顯微鏡檢測泡沫細胞內(nèi)Ca2+濃度（激光共聚焦顯微鏡）本文檔共74頁；當前第19頁；編輯于星期一\11點43分對VSMC源性泡沫細胞內(nèi)CD36mRNA表達的影響光鏡觀察空白對照組10x40生理鹽水組10x40洛伐他汀組10x40脂欣康組10x40血脂康組10x40羅格列酮組10x40原位雜交法檢測B類清道夫受體CD36mRNA表達（原位雜交法）本文檔共74頁；當前第20頁；編輯于星期一\11點43分對VSMC源性泡沫細胞內(nèi)CD36mRNA表達的影響各組平滑肌源性泡沫細胞內(nèi)CD36mRNA表達比較B類清道夫受體白細胞分化抗原36配體（CD36）

（原位雜交法）本文檔共74頁；當前第21頁；編輯于星期一\11點43分小結(jié)脂欣康具有與洛伐他汀等相似的顯著降低總膽固醇及膽固醇酯含量的作用，并且膽固醇酯與總膽固醇的比值均降至50%以下；脂欣康具有與洛伐他汀相似的抑制平滑肌源性泡沫細胞內(nèi)CD36mRNA表達的作用，并且優(yōu)于洛伐他??；脂欣康可顯著降低平滑肌源性泡沫細胞內(nèi)的Ca2+濃度，優(yōu)于洛伐他汀及血脂康。本文檔共74頁；當前第22頁；編輯于星期一\11點43分小結(jié)脂欣康與血脂康均顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC泡沫化，從而抗As斑塊形成，并有助于穩(wěn)定斑塊。

其作用機制：調(diào)脂、改善脂質(zhì)代謝降低細胞內(nèi)鈣負荷抑制細胞內(nèi)CD36mRNA的表達

本文檔共74頁；當前第23頁；編輯于星期一\11點43分中醫(yī)藥對As泡沫化細胞干預(yù)研究其它學者研究工作抗氧化As泡沫化細胞調(diào)節(jié)血脂抑制炎癥介質(zhì)減少細胞外基質(zhì)降解刺梨汁大黃醇提液甲基蓮心堿漏蘆馬齒莧三七總皂苷扇貝裙邊糖胺聚糖小檗堿益氣活血化痰法等繼續(xù)挖掘能夠干預(yù)As泡沫化細胞的中藥并對其作用機制進行深入研究，對于防治As具有重要的意義。

激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）本文檔共74頁；當前第24頁；編輯于星期一\11點43分第二部分中醫(yī)藥干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞泡沫化及其機制研究

本文檔共74頁；當前第25頁；編輯于星期一\11點43分ApoE基因敲除小鼠AS模型ApoE基因敲除小鼠于1992年培育成功自然發(fā)生漸進發(fā)展病理形態(tài)典型病變接近于人類研究As的較理想動物模型本文檔共74頁；當前第26頁；編輯于星期一\11點43分ApoE基因敲除小鼠AS模型本科研團隊的研究研究進程2000年開始，在國內(nèi)外率先應(yīng)用ApoE基因敲除小鼠開展心血管病與老年病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。2002年開始，發(fā)表系列論文。2002年，山東生物醫(yī)學工程（第4期）：載脂蛋白E基因敲除小鼠在動脈粥樣硬化研究中的應(yīng)用；2003年，中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志（第8期）：中西藥物對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的干預(yù)作用；2003年，中國動脈硬化雜志（第5期）：血脂康對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響本文檔共74頁；當前第27頁；編輯于星期一\11點43分ApoE基因敲除小鼠

巨噬細胞源性泡沫細胞模型ApoE在體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運過程中作為脂蛋白配體發(fā)揮作用，當ApoE缺乏時，由其誘導(dǎo)的膽固醇外流受阻，ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞轉(zhuǎn)化為泡沫細胞過程中，膽固醇酯蓄積更加明顯，更容易形成As病變，是作為體外培養(yǎng)巨噬細胞源性泡沫細胞模型進行干預(yù)研究的較理想選擇。本文檔共74頁；當前第28頁；編輯于星期一\11點43分中醫(yī)藥干預(yù)ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞泡沫化及機制本科研團隊的研究研究內(nèi)容ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)泡沫化

干預(yù)PPARγ、CD36、ABCA1信號通路

抑制TLR4表達及炎癥反應(yīng)

拮抗細胞內(nèi)鈣離子水平

降低膽固醇濃度

脈心康膠囊降脂紅曲虎杖、山楂及其配伍本文檔共74頁；當前第29頁；編輯于星期一\11點43分一、脈心康干預(yù)ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞泡沫化及其機制研究方藥組成：人參銀杏葉降脂紅曲綠茶功效成分組方人參皂苷銀杏葉提取物降脂紅曲超微粉茶多酚中醫(yī)藥功效：益氣活血解毒化濁脈心康膠囊本文檔共74頁；當前第30頁；編輯于星期一\11點43分研究分組脈心康組洛伐他汀組羅格列酮組生理鹽水組空白對照組——不加含藥血清分別加入含藥血清含藥血清干預(yù)時間——72小時

本文檔共74頁；當前第31頁；編輯于星期一\11點43分（激光共聚焦顯微鏡）脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性泡沫細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響本文檔共74頁；當前第32頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞PPARγ蛋白表達的調(diào)控作用（免疫組化法，PPARγ蛋白表達）本文檔共74頁；當前第33頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞ABCA1蛋白表達的調(diào)控作用（免疫組化法，ABCA1蛋白表達）本文檔共74頁；當前第34頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞CD36蛋白表達的調(diào)控作用（流式細胞術(shù)，CD36蛋白表達）本文檔共74頁；當前第35頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞PPARγmRNA表達的調(diào)控作用（原位雜交法，PPARγmRNA表達）本文檔共74頁；當前第36頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞ABCA1mRNA表達的調(diào)控作用（原位雜交法，ABCA1mRNA表達）本文檔共74頁；當前第37頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞CD36mRNA表達的調(diào)控作用（原位雜交法，CD36mRNA表達）本文檔共74頁；當前第38頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞培養(yǎng)液TNF-α的影響（ELISA法，TNF-α）本文檔共74頁；當前第39頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞培養(yǎng)液IL-1β的影響（ELISA法，IL-1β）本文檔共74頁；當前第40頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞內(nèi)總膽固醇的影響（高效液相色譜法，總膽固醇）本文檔共74頁；當前第41頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性

泡沫細胞內(nèi)膽固醇酯的影響（高效液相色譜法

，膽固醇酯）本文檔共74頁；當前第42頁；編輯于星期一\11點43分脈心康對ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞源性泡沫細胞內(nèi)膽固醇酯/總膽固醇比值的影響本文檔共74頁；當前第43頁；編輯于星期一\11點43分結(jié)論以ox-LDL誘導(dǎo)24小時、48小時、72小時后，鏡下觀察可見巨噬細胞泡沫化程度隨時間逐漸加重脈心康含藥血清干預(yù)后，細胞內(nèi)膽固醇酯、總膽固醇含量及其比值均顯著降低細胞內(nèi)鈣離子水平顯著降低PPARγ、ABCA1蛋白及mRNA表達均顯著增加CD36蛋白及mRNA表達顯著減少細胞培養(yǎng)液中TNF-、IL-1β含量顯著降低本文檔共74頁；當前第44頁；編輯于星期一\11點43分結(jié)論脈心康干預(yù)巨噬細胞泡沫化的機制，與以下幾方面有關(guān)：抑制膽固醇積聚拮抗細胞內(nèi)鈣超載激活PPARγ信號通路抑制炎癥反應(yīng)本文檔共74頁；當前第45頁；編輯于星期一\11點43分ApoE（-/-）小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)分為B-G組與ox-LDL+LPS共孵育，并分別加藥干預(yù)B虎杖苷C山楂提取物D虎杖苷山楂提取物組E洛伐他汀組F羅格列酮組G模型組A空白對照分別觀察0、24、48h三個不同時相的以下指標變化WesternblotELISATLR4NF-BTNF-αIL-1β數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析二、解毒活血配伍干預(yù)ApoE基因敲除小鼠巨噬細胞泡沫化及機制研究本文檔共74頁；當前第46頁；編輯于星期一\11點43分巨噬細胞泡沫化以ox-LDL與LPS聯(lián)合誘導(dǎo)ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞泡沫化聯(lián)合誘導(dǎo)24小時及48小時顯微鏡下觀察可見巨噬細胞均泡沫化泡沫化程度隨時間逐漸加重且以ox-LDL與LPS聯(lián)合誘導(dǎo)組較單純以ox-LDL誘導(dǎo)組泡沫化程度更明顯透射電鏡下觀察可見細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈不同程度破壞

本文檔共74頁；當前第47頁；編輯于星期一\11點43分48小時空白組、模型組、解毒活血配伍組細胞電鏡圖片（6000)

空白組模型組解毒活血配伍組透射電鏡觀察結(jié)果本文檔共74頁；當前第48頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化

###**##*********（激光共聚焦顯微鏡）本文檔共74頁；當前第49頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)總膽固醇含量##**********本文檔共74頁；當前第50頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)游離膽固醇含量********本文檔共74頁；當前第51頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)膽固醇酯含量***####**********本文檔共74頁；當前第52頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)PPARγmRNA相對表達量*************######（RT-PCR法）本文檔共74頁；當前第53頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)ABCA1mRNA相對表達量**************######（RT-PCR法）本文檔共74頁；當前第54頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)CD36mRNA相對表達量**********######（RT-PCR法）本文檔共74頁；當前第55頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)TLR4蛋白相對表達量

***********######（Westernblot法）本文檔共74頁；當前第56頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)NF-κB蛋白相對表達量***********#######（Westernblot法）本文檔共74頁；當前第57頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)TNF-α含量**************#####（ELISA法）本文檔共74頁；當前第58頁；編輯于星期一\11點43分不同時相各組巨噬細胞內(nèi)IL-1β含量*************#####（ELISA法）本文檔共74頁；當前第59頁；編輯于星期一\11點43分結(jié)果虎杖苷、山楂提取物及兩者配伍干預(yù)后：明顯減輕細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞程度顯著上調(diào)細胞內(nèi)PPARγ、ABCA1的mRNA表達,下調(diào)CD36的mRNA表達降低Toll樣受體4（TLR4）、核因子-B（NF-B）、IL-1β及TNF-的表達減少細胞內(nèi)游離鈣離子濃度降低細胞內(nèi)膽固醇酯、總膽固醇含量及其比值兩者配伍干預(yù)巨噬細胞泡沫化在部分指標方面明顯優(yōu)于單用虎杖苷或山楂提取物

本文檔共74頁；當前第60頁；編輯于星期一\11點43分結(jié)論虎杖苷、山楂提取物及其配伍通過保護細胞超微結(jié)構(gòu)激活PPARγ相關(guān)信號通絡(luò)、抑制TLR4相關(guān)信號通路及炎癥反應(yīng)拮抗細胞內(nèi)鈣超載促進細胞內(nèi)膽固醇外流等途徑抑制巨噬細胞泡沫化過程，延緩As的發(fā)生發(fā)展。

本文檔共74頁；當前第61頁；編輯于星期一\11點43分其他學者的相關(guān)研究

張代娟等取ApoE基因敲除小鼠胸主動脈，進行平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞以及巨噬細胞培養(yǎng)，以LPS誘導(dǎo)細胞泡沫化，以青心酮進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)青心酮能夠明顯降低血管平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞的TLR4蛋白含量，在一定程度上減少As病灶的形成，推測青心酮可能通過TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抗As作用。

本文檔共74頁；當前第62頁；編輯于星期一\11點43分第三部分本研究成果的臨床應(yīng)用本文檔共74頁；當前第63頁；編輯于星期一\11點43分益氣活血解毒化濁

復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用脂欣康膠囊脈心康膠囊本文檔共74頁；當前第64頁；編輯于星期一\11點43分脂欣康膠囊

脈心康膠囊高脂血癥動脈粥樣硬化（頸動脈粥樣硬化）延緩斑塊發(fā)展減輕斑塊穩(wěn)定斑塊冠心病不穩(wěn)定性心絞痛本文檔共74頁；當前第65頁；編輯于星期一\11點43分解毒與活血配伍

抗動脈粥樣硬化穩(wěn)定斑塊本文檔共74頁；當前第66頁；編輯于星期一\11點43分解毒與活血配伍抗動脈粥樣硬化穩(wěn)定斑塊的意義與臨床價值活血化瘀As的炎癥理論毒邪清熱解毒As的主要治法活血解毒本科研團隊的研究理論探討本文檔共74頁；當前第67頁；編輯于星期一\11點43分解毒與活血配伍抗動脈粥樣硬化穩(wěn)定斑塊的意義與臨床價值本科研團隊的研究研究假說不穩(wěn)定心絞痛具有毒邪致病的特點，毒損心絡(luò)為其重要病機，解毒為其重要治法。“毒、瘀致易損斑塊”和“解毒活血法穩(wěn)定易損斑塊”