免疫組化步驟

免疫組化流程固定灌流后盡快取出腎臟（1-2分鐘內(nèi)完成），剝除筋膜和其他結(jié)締組織，取皮質(zhì)削成薄片，（易于固定液的浸透），置于DwbosyBra液24小時(shí)，按照D程序轉(zhuǎn)缸。包埋蠟塊 皮質(zhì)朝下，組織放平切片切2-3微米，用多聚賴氨酸處理的玻片撈組織，用吹風(fēng)機(jī)吹熔組織。如暫時(shí)不做，放-20°凍存，室溫放置過(guò)久，抗原會(huì)丟失烤片：烤箱60°1小時(shí)后盡快放入二甲苯缸脫蠟脫蠟及水化：二甲苯1 二甲苯2二甲苯3無(wú)水乙醇 90%乙醇75%乙醇，每缸10分鐘抗原修復(fù)先用微波爐將緩沖液中火3分鐘煮沸，再將片子置入，低火10-20分鐘修復(fù)抗原3%Hg室溫孵育10分鐘，PBST3min洗三次羊血清室溫孵育15分鐘，不洗一抗4°過(guò)夜，PBST3min洗三次生物素化的二抗15分鐘，PBST3min洗三次親和素一一鏈霉素一一過(guò)氧化物酶復(fù)合物即“三抗”15分鐘，PBST3min洗三次DAB顯色核復(fù)染蘇木素5min 鹽酸酒精1min 氨水5min，染完沖水，風(fēng)干14.中性樹(shù)膠封片，37°烘片2小時(shí)建議：1、全程盡可能減少干片的機(jī)會(huì)，以降低非特異性染色2、抗原修復(fù)應(yīng)在H2O2之后，以便高溫時(shí)進(jìn)一步脫蠟重要步驟說(shuō)明：1、 標(biāo)本固定固定的目的：1） 保持組織細(xì)胞原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)2） 使組織硬化固定的優(yōu)、缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：使組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)得到保持缺點(diǎn)：擬檢物質(zhì)反應(yīng)性減弱，酶的活性易受損2、 脫蠟及水化這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。水化用梯度乙醇（由高到低即無(wú)水乙醇---90%---75%）。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。3、 抗原修復(fù)抗原修復(fù)的原因：固定液中的醛基與抗原蛋白的氨基酸殘基交聯(lián)形成羧甲基,使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙，再則由于分子間的交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露，這些均可造成假陰性的染色結(jié)果。因此，用醛類(lèi)固定劑固定的組織，除非特殊說(shuō)明，均應(yīng)常規(guī)做抗原復(fù)。修復(fù)方法：常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。需要根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)的要求，選擇最為合適的修復(fù)方法。我們選用的抗體一般用PH6.0檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)。注意微波修復(fù)后自然冷卻30min左右（修復(fù)液的溫度達(dá)室溫即可）。4、 細(xì)胞組織通透目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用。在免疫組織化學(xué)（＞10um厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用TritonX-100作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。5、 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須用過(guò)氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而0.3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般10~30min;用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用。過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片。6、 血清封閉組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性；封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。7、 抗體的孵育一抗孵育條件很重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4°、室溫、37°，其中4°效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37°1-2h,4°過(guò)夜。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37°30min-1h或者遵照試劑盒說(shuō)明。8、 抗體稀釋其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專(zhuān)用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好。9、 切片清洗為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，此外PBS+Tween-20能增強(qiáng)洗滌效果的同時(shí)，還能使切片不容易干片，而且能節(jié)省試劑。（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。（3）沖洗的時(shí)間足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。中性及弱堿性條件（PH7-8）有利免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利其分解；低離子強(qiáng)度有利免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利其分解。10、 DAB顯色背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的， 由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到顯特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗。DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就顯出很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需下調(diào)抗體濃度或縮短抗體孵育時(shí)間；此外，若很短時(shí)間就出背景很深，還有可能前面的封閉非特異性蛋白不全，需延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗4°過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。11、 核復(fù)染目的顯出組織輪廓，從而更好地對(duì)目的蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染。蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目的抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，而胞核蛋白則應(yīng)短一些。染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒(一定動(dòng)作作快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭。12、封片為了長(zhǎng)期保存，我們一般用中性樹(shù)膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。封完片以后，若發(fā)現(xiàn)仍有氣泡，可放在平整放置在37°溫箱2小時(shí)，以利于氣泡的排出。常用試劑的配制1、 PBST緩沖液(pH7.2?7.4)：NaCl8g,KCl0.2g,Na『PO43.57gKH2PO40.2g)Tween-201ml,雙蒸水1000ml,充分溶解后調(diào)PH至7.4.2、 0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB,pH6.0,1000ml)