人類染色體疾病的診斷三

關(guān)于人類染色體疾病的診斷三第1頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三染色體顯帶技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)染色體顯帶是細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)中不可替代的基本方法?！敖饦?biāo)準(zhǔn)”操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)可以提供核型的完整圖像影響因素：染色體相似性很強(qiáng)，復(fù)雜畸變時(shí)；或畸變微?。ㄈ缛笔?lt;5Mb)，不足以引起圖像明顯變化時(shí)，結(jié)果分析困難。耗時(shí)（培養(yǎng)需72小時(shí)）且依賴于獲得良好的分裂相，而有的標(biāo)本中分裂指數(shù)低，或染色體形態(tài)學(xué)表型差。

第2頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一、FISH原理（一）、幾個(gè)概念雜交原位雜交熒光原位雜交依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性原理，用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針檢測(cè)樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同源核酸序列，這一過程叫做雜交。原位雜交(insituhybridization)是用已標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序列雜交,從而對(duì)組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析。第3頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三原位雜交1）同位素原位雜交(Isotopicinsituhybridization)——70年代2）非同位素原位雜交(Non-isotopicinsituhybridization)——80年代中后期（1）免疫酶聯(lián)（2）熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)**同位素原位雜交的不足：1）不穩(wěn)定；2）高背景；3）曝光時(shí)間長(zhǎng)；4）結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理繁瑣;5）同位素的使用和處理第4頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三熒光原位雜交（FISH）

FISH技術(shù)是常規(guī)染色體分析的輔助手段。它是用熒光素標(biāo)記特異探針，與染色體做雜交后，根據(jù)特異的熒光信號(hào)來判斷結(jié)果。它可用于標(biāo)記染色體的識(shí)別、特異融合基因的檢測(cè)，并可廣泛用于腫瘤的診斷分型，新基因定位，用全染色體涂抹探針識(shí)別復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)異常等。第5頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三原理：通過觀察熒光信號(hào)在染色體上的位置來反映相應(yīng)基因的情況。第6頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第7頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二、FISH的優(yōu)點(diǎn)：1.操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年。2.方法敏感，能迅速得到結(jié)果。3.在同一標(biāo)本上，可同時(shí)幾種不同探針，顯示DNA片段及基因之間的相對(duì)位置與方向，空間定位精確；可以檢測(cè)隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型。4.不僅可用于分裂細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于靜止期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究。第8頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三三、FISH探針

用生物素或地高辛標(biāo)記稱為間接標(biāo)記。

雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測(cè)方能看到熒光信號(hào)。優(yōu)點(diǎn)：在信號(hào)較弱或較小時(shí)可經(jīng)抗原抗體反應(yīng)擴(kuò)大缺點(diǎn)步驟較多,操作麻煩。（一）、直接標(biāo)記和間接標(biāo)記第9頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三直接用熒光素標(biāo)記DNA的方法稱為直接標(biāo)記。優(yōu)點(diǎn)：由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號(hào),省去了煩瑣的免疫熒光反應(yīng)。由于近年來熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高,直接標(biāo)記的熒光探針應(yīng)用越來越多。第10頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三探針標(biāo)記在已知探針DNA結(jié)構(gòu)及序列情況下可采用PCR或RNA逆轉(zhuǎn)錄法標(biāo)探針。通常用Biotin標(biāo)記的探針應(yīng)大于100bp，較小的探針可采用PCR技術(shù)來標(biāo)記。近年來，VYSIS公司成功的生產(chǎn)了大片段的DNA探針（100─400kb）。由于探針較長(zhǎng)，故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，這不僅使雜交過程進(jìn)一步簡(jiǎn)化面且雜交信號(hào)增強(qiáng)。第11頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三（二）、FISH探針的種類1）單拷貝探針：（1）種類：酵母人工染色體（YAC），細(xì)菌人工染色體（BAC），Cosmid，Plasmid，cDNA片段（2）應(yīng)用（a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證；（b）確定染色體微小缺失與重復(fù)；（c）染色體斷裂點(diǎn)分析。第12頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三２）簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針(simplerepetitiveprobes）其靶序列為α衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星IIIDNA(alphasatellite/satelliteIIIDNA)多位于染色體的著絲粒，異染色質(zhì)區(qū)域和端粒，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次。特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)應(yīng)用：(a)標(biāo)記染色體識(shí)別(b)染色體數(shù)目異常檢測(cè)(c)同時(shí)由于G顯帶時(shí)，端粒區(qū)是蒼白的，因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測(cè)，而應(yīng)用端粒探針則彌補(bǔ)了G顯帶的不足第13頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三3）染色體涂染探針（chromosomepaintingprobes)整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針包括通過流式細(xì)胞儀（FACS）分選或顯微切割獲得的全染色體，染色體臂，或染色體特異性區(qū)帶涂抹探針應(yīng)用：檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。第14頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三四、FISH的臨床應(yīng)用

第15頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三1.在細(xì)胞遺傳學(xué)檢查中，重復(fù)序列的探針應(yīng)用最多，它們是α衛(wèi)星DNA、β衛(wèi)星DNA和經(jīng)典衛(wèi)星DNA探針。α衛(wèi)星DNA探針主要檢測(cè)人染色體的著絲粒。β衛(wèi)星DNA位于頂端著絲粒染色體及染色體的異染色質(zhì)周圍。經(jīng)典衛(wèi)星DNA有著AATGG短片段，位于染色體1、9、15、16和Y染色體長(zhǎng)臂異染色質(zhì)周圍，后兩處探針除了可用于染色體數(shù)目檢查外，還可用于上述部位精細(xì)改變的檢查。第16頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三染色體著絲粒熒光第17頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三染色體端粒熒光第18頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三FISH檢測(cè)18三體及Turner綜合征結(jié)果

左圖：18（藍(lán)色）X(綠色)Y（紅色）探針，顯示18號(hào)、X和Y染色體為正常；

中圖：18三體綜合征病例的FISH結(jié)果，有三個(gè)藍(lán)色信號(hào)（18號(hào)）；

右圖：Turner綜合征病例的FISH結(jié)果，1個(gè)綠色信號(hào)（X單體）

第19頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三FISH檢測(cè)21三體綜合征結(jié)果

左圖：以13（綠色）21（紅色）為探針，顯示13號(hào)和21號(hào)染色體為正常；

中圖及右圖：21三體綜合征病例的FISH結(jié)果，有三個(gè)紅色信號(hào)（21號(hào)）。第20頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三對(duì)于臨床來說，對(duì)母血清唐氏篩查異常的高危孕婦，可以考慮選擇FISH檢測(cè)。

因?yàn)檠鍖W(xué)篩查主要針對(duì)21、18、13一三體發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的統(tǒng)計(jì)，80％的常見染色體異常發(fā)生在2l、18、l3、X及Y這5對(duì)染色體，而FISH針對(duì)這些血清學(xué)異常已達(dá)到很高的特異性及敏感性，且FISH的快速簡(jiǎn)便，可以極大的緩解孕婦的焦慮情緒。晚孕期的的孕婦也建議使用FISH檢測(cè)。

因?yàn)橥碓衅谘蛩囵B(yǎng)失敗率較高，而臍血穿刺流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)較高，選擇FISH檢測(cè)快速用于臨床診治指導(dǎo)，減輕孕婦的焦慮及負(fù)擔(dān)。

第21頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三FISH檢測(cè)與傳統(tǒng)核型分析相比具有對(duì)孕周無嚴(yán)格要求，快速，簡(jiǎn)便，需要樣本量小，可以檢測(cè)微小缺失等優(yōu)點(diǎn)，但它也有僅能檢出部分染色體數(shù)目異常，不能檢出染色體結(jié)構(gòu)異常的缺點(diǎn)。

第22頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三2.血液病檢測(cè)大部分白血病存在某種染色體易位，產(chǎn)生新的融合基因，編碼新的融合蛋白。利用這些標(biāo)志可以診斷不同類型的白血病。特殊染色體異常往往同時(shí)有特征性的形態(tài)學(xué)異常和獨(dú)特的臨床特點(diǎn)，染色體核型與AML患者的預(yù)后和治療密切相關(guān)，因此細(xì)胞遺傳學(xué)在WHO分型中占據(jù)了重要地位。例如：WHO2001年建議，急性白血?。ˋML）被劃分為以下四組：

(1)急性髓系白血病伴重現(xiàn)性染色體異常；(2)急性髓系白血病伴有多系細(xì)胞增生異常；(3)治療相關(guān)的急性髓系白血病與骨髓增生異常綜合征；(4)不能歸類的急性髓系白血病。第23頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

檢查初始治療

HLA配型體格檢查SouthernBCR-ABL陰性

血小板、血細(xì)胞記數(shù)Ph1陰性WesternBMTa

生化全套PCR成人CML骨穿±活檢FISHBCR-ABL陽性慢性期形態(tài)學(xué)觀察幼稚細(xì)胞百分比進(jìn)行起始治療（CML-2）嗜堿性細(xì)胞百分比

核型分析

Ph1陽性a

NCCN:國(guó)家綜合腫瘤網(wǎng)腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指導(dǎo)

2004年第一版

慢性髓性白血病2004年第一版第24頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞遺傳學(xué)和血液學(xué)緩解的標(biāo)準(zhǔn)1血液學(xué)完全緩解末梢血完全正常，白細(xì)胞<10×109/L

血小板<450×109/L

末梢血中沒有不成熟細(xì)胞象髓細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞及幼稚細(xì)胞。沒有疾病的癥狀及體征和重新出現(xiàn)的可觸及的脾腫大。細(xì)胞遺傳學(xué)緩解2

完全緩解：沒有Ph陽性的分裂象部分緩解：1%-34%Ph陽性的分裂象輕微緩解：35%-90%Ph陽性的分裂象部分血液學(xué)緩解同完全血液學(xué)緩解相同除外：存在幼稚細(xì)胞血小板較治療前減少50%，但>450×109/L

持續(xù)脾大但范圍小于治療前的50%。1摘自FaderiD等所著：《慢性粒細(xì)胞白血?。荷飳W(xué)及治療》。發(fā)表于AnnInternMed131:207-219,1999。2至少檢查20個(gè)分裂象。第25頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三腫瘤基因變異（或統(tǒng)稱突變）的發(fā)生是一個(gè)累積的和概率的過程。我們每個(gè)人體內(nèi)都在發(fā)生著突變，實(shí)際上大多數(shù)突變是無意義的，因此，一個(gè)腫瘤患者基因組內(nèi)可能有很多變異，可以表現(xiàn)為不同的形式。有的是決定意義的，比如BCR-ABL1融合基因；有的也有一定的輔助意義，如復(fù)雜的染色體異常或特定的基因變異。不僅腫瘤的發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，腫瘤發(fā)生后它的基因組也在持續(xù)的發(fā)生著動(dòng)態(tài)的變化。一旦出現(xiàn)了新的有意義的突變，還會(huì)導(dǎo)致疾病的進(jìn)展。如部分CML患者發(fā)病時(shí)只能看到和檢測(cè)到BCR-ABL1融合基因，但發(fā)生急變時(shí)就能看到復(fù)雜的染色體異?；騃KZF1基因的變化。實(shí)際上是由于后來發(fā)生了更多的基因的異常，才導(dǎo)致了CML進(jìn)展為急性白血病。第26頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三FISH檢測(cè)不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，是臨床遺傳學(xué)檢測(cè)的有效補(bǔ)充手段：

傳統(tǒng)的染色體檢查方法周期長(zhǎng)，人工消耗大，而且染色體分析需要有較好質(zhì)量的中期分裂相。白血病患者腫瘤細(xì)胞中期分裂相不易獲得，而且有些重要預(yù)后意義的累及基因位點(diǎn)的微缺失或僅存在于間期細(xì)胞中的異常，傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)是不能檢測(cè)出來的。

熒光原位雜交技術(shù)不需要中期分裂相，因此可分析大量間期細(xì)胞，且具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、敏感性和特異性高的優(yōu)點(diǎn)。但需要指定基因特異性的探針，失去了核型分析的宏觀性。第27頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三Translocationt(9;22)(q34;q11)第28頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三Translocationt(9;22)(q34;q11)第29頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三在正常的細(xì)胞中，兩個(gè)紅點(diǎn)和兩個(gè)綠點(diǎn)分別表示正常的ABL和BCR基因的正常位置。在不正常的細(xì)胞中，BCR-ABL融合基因呈現(xiàn)為紅綠兩種顏色的融合，這種融合基因常常在觀察中顯示為黃色熒光（箭頭所指）。第30頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三五、幾種新技術(shù)介紹第31頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三1.多色熒光原位雜交（M-FISH）采用全染色體探針（WCP）與染色體雜交，分析染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常的分子生物學(xué)方法。探針是經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)(Degenerateoligonucleotideprimedpolymerasechainreaction,DOP-PCR)擴(kuò)增、流式分選、并用5種熒光素組合熒光標(biāo)記法標(biāo)記的同源染色體。這種經(jīng)過標(biāo)記的探針集合(Pool)與制備好的間期細(xì)胞染色體雜交,可使雜交后的每條染色體表現(xiàn)出獨(dú)有的顏色,從而能夠分辨出人的22對(duì)常染色體和X、Y兩條性染色體(圖2[15]),雜交后的圖像通過濾光裝置被計(jì)算機(jī)獲得并分析得出結(jié)果。如果一條染色體的顏色不相同,則提示該條染色體有重組現(xiàn)象,根據(jù)每條染色體各自獨(dú)有的顏色,可以知道哪幾條染色體之間進(jìn)行了重組[第32頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三M-FISH對(duì)染色體間復(fù)雜易位的分析有突出優(yōu)勢(shì),但是對(duì)染色體微小易位(<1MB)的分析則受到限制,而對(duì)染色體內(nèi)部異常的分析則無能為力,這包括染色體的擴(kuò)增、微小缺失和倒位第33頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三染色體光譜核型比對(duì)分析技術(shù)（SKY-spectral-karyotyping)-創(chuàng)新的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常檢查工具原理：光譜核型分析SKY經(jīng)由CCD相機(jī)擷取圖像，利用光譜干涉儀及傅立葉轉(zhuǎn)換技術(shù)，分辨獲得圖像每一像素點(diǎn)的光譜，以此標(biāo)定出不同光譜的不同顏色。優(yōu)勢(shì)：對(duì)比傳統(tǒng)的M-FISH,光譜核型分析技術(shù)的采用優(yōu)勢(shì)無法比擬。一傳統(tǒng)的技術(shù)使用顯微鏡熒光濾鏡來分辨熒光信號(hào)，缺點(diǎn)存在嚴(yán)重的熒光信號(hào)干擾（cross-talk),信號(hào)重疊，信號(hào)位移等，無法有效分辨染色體，也無法準(zhǔn)確診斷染色體的細(xì)微變異，異位。而SKY完全克服以上缺點(diǎn)，對(duì)圖像每一像素的光譜標(biāo)以不同顏色，顯而易見。二從成本上看，不需要電動(dòng)顯微鏡，熒光濾鏡僅使用一顆SKY濾鏡，SKYPaint探針做一次雜交，一次圖像擷取，讓使用人員減輕時(shí)間，精力，同時(shí)獲取穩(wěn)定結(jié)果。第34頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第35頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三4.比較基因組雜交

ComparativeGenomicHybridization(CGH)

原理：在熒光原位雜交基礎(chǔ)上，結(jié)合消減雜交技術(shù)而發(fā)展起來的技術(shù)，主要用于腫瘤的檢測(cè)及其基因組分析是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是檢測(cè)整個(gè)腫瘤基因組DNA增加或減少的強(qiáng)有力的工具第36頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三比較基因組雜交（CGH）CGH不需要制備患者的染色體標(biāo)本,只需采用腫瘤患者的基因組DNA和正常人的基因組DNA作為探針，與正常人的中期染色體分裂相進(jìn)行雜交。比較兩種探針?biāo)鶚?biāo)的熒光信號(hào)的強(qiáng)度比率來判斷腫瘤患者的DNA是否存在缺失、增加或復(fù)制。因而CGH最適合于檢測(cè)實(shí)體瘤,淋巴瘤等不易得到高質(zhì)量染色體標(biāo)本的疾病.CGH另一無法替代的優(yōu)點(diǎn)是,它可在一次雜交中檢測(cè)整個(gè)基因遺傳物質(zhì)的增加或減少,但精度有限,對(duì)微小的擴(kuò)增或缺失檢測(cè)不出,僅適用于對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行篩查.CGH也無法發(fā)現(xiàn)平衡染色體易位.第37頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三比較基因組雜交原理示意

腫瘤DNA和對(duì)照DNA在染色體上的相對(duì)結(jié)合量取決于兩種DNA標(biāo)本中相應(yīng)雜交序列的多少因此可根據(jù)不同熒光強(qiáng)度的比率而定量分析腫瘤基因組中DNA的增加或丟失等比混合第38頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三比較基因組雜交過程第39頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三DAPI4’,6-二聯(lián)脒-2-吲哚苯FITC異硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基羅丹明人染色體不同熒光素染色結(jié)果第40頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三數(shù)字化圖像第41頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三FITC/TRITC熒光強(qiáng)度比率分析圖RatioimageFITC/TRITC第42頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第43頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三比較基因組雜交應(yīng)用范疇可在基因組水平上對(duì)染色體變異部位進(jìn)行準(zhǔn)確的定量定位分析；不需要細(xì)胞培養(yǎng)可對(duì)腫瘤基因組DNA的拷貝數(shù)進(jìn)行定性分析與定量分析；對(duì)細(xì)胞遺傳學(xué)難以判斷的腫瘤染色體的某些成分（如雙微體、標(biāo)記染色體）的來源進(jìn)行鑒定；快速檢出染色體三體性、單體性和部分染色體大片段重復(fù)的拷貝數(shù)變化，有利于對(duì)先天畸形、自然流產(chǎn)等疾病進(jìn)行快速診斷。第44頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三優(yōu)勢(shì)：

可快捷檢測(cè)中期、間期基因組不需預(yù)先知道DNA發(fā)生改變的部位一次實(shí)驗(yàn)即可檢出待測(cè)樣本整個(gè)基因組拷貝數(shù)的增減第45頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三多色信號(hào)采集常規(guī)的熒光顯微鏡的熒光顯微鏡的照像，彩色膠片不易多次曝光，限制了這種聯(lián)合標(biāo)記探針的應(yīng)用，使用CCD照像系統(tǒng)，先分別多次攝取灰色的影像關(guān)儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)內(nèi)，而后冠以人為的顏色，運(yùn)用軟件系統(tǒng)融合各次得到的影像，最終形成一個(gè)復(fù)合的多顏色的圖像。第46頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三FISH和G顯帶技術(shù)結(jié)合對(duì)已做過G顯帶的染色體片子用75%的乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰的辨認(rèn)各條染色體及染色體結(jié)構(gòu)異常（包括某些復(fù)雜的易位，插入，倒位等）,不僅可以用新近G帶外理過的片子，而且還可用陳舊的G帶片子。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)可成功的幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析。第47頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三FISH技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合FISH技術(shù)和RFLP結(jié)合，可以精確地描述原屬于染色本長(zhǎng)短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體核形或復(fù)雜片段的性質(zhì)。FI