第九節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

第九節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)演示文稿本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分優(yōu)選第九節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分一、微生物菌種保藏在一定時(shí)間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：基本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分

由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對(duì)不同的保藏方法有不同的適應(yīng)性，因此，在具體選擇保藏方法時(shí)必須對(duì)被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點(diǎn)及現(xiàn)有條件等進(jìn)行綜合考慮。

對(duì)于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進(jìn)行保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分國(guó)際重要菌種保藏機(jī)構(gòu)本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分中國(guó)菌種保藏單位本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

(1)超低溫或在液氮中冷凍保藏；(2)冷凍干燥或真空干燥保藏；

(3)

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?/p>

(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分菌種保藏方法

暫時(shí)保藏法

斜面?zhèn)鞔ù┐谭?/p>

長(zhǎng)期保藏法

液體石蠟法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法濾紙片保藏法冷凍干燥保藏法液氮冷凍法

本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分2.1

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡(jiǎn)單而有效的方法。通過(guò)冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿(mǎn)意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20℃以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分冷凍保藏種類(lèi)

一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)三、液氮冷凍保藏技術(shù)

本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中?；蛘?，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長(zhǎng)適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分應(yīng)注意的是經(jīng)過(guò)一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來(lái)保藏。保藏過(guò)程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過(guò)此保藏方法保藏5年而活力不受影響。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分三、液氮冷凍保藏技術(shù)

(一)冷凍保護(hù)劑

在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過(guò)濾滅菌。

本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟

1．待冷凍保藏菌種懸液的制備

(1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶。

本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分(2)從浸沒(méi)培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒(méi)培養(yǎng)液中加入等體積20%無(wú)菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分2．控速冷凍．(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無(wú)控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分(三)復(fù)蘇1．從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解；3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無(wú)菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分2.2

凍干保藏

冷凍干燥的基本方法：是通過(guò)在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的最為有效的方法之一。冷凍干燥過(guò)程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國(guó)內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國(guó)外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的。大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分培養(yǎng)物的凍干過(guò)程本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分冷凍真空干燥操作流程安培瓶配制保護(hù)劑滅菌菌種培養(yǎng)制備菌懸液分裝安培瓶洗凈烘干裝標(biāo)簽加棉塞預(yù)凍真空干燥測(cè)定水分熔封管口檢查真空度包藏本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分(三)凍干菌種的保藏與再生1．保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于5℃下保藏。較低的保藏溫度(-20～-70℃)對(duì)于培養(yǎng)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好。2．復(fù)蘇：(1)在超凈工作臺(tái)中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無(wú)菌紗布或無(wú)菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開(kāi)安瓿。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分(3)在安瓿中加入0.5～1ml營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)～2ml液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩5～l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分2.3傳代保藏將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長(zhǎng)溫度下生長(zhǎng)和保存的傳代保藏方法。可用于實(shí)驗(yàn)室中若干菌種的保藏。此法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分2.3傳代培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)原理：保藏的菌種通過(guò)斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細(xì)菌）培養(yǎng)好后，置4C?冰箱中存放，定期進(jìn)行傳代培養(yǎng)、再存放?？捎媚z塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無(wú)菌液體石蠟來(lái)進(jìn)一步延長(zhǎng)保存期。操作方法

1、斜面保藏法將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長(zhǎng)后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C?冰箱中包藏。保藏時(shí)間依微生物的種類(lèi)而定。霉菌、放線(xiàn)菌及芽孢菌保存2－4個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，普通細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、使用方便，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間短、易被污染。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分2、液體石蠟保藏法將無(wú)菌石蠟加在已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存。此法實(shí)用且效果較好。霉菌、放線(xiàn)菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán)，置4℃冰箱存放。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分礦物油中浸沒(méi)保藏將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡(jiǎn)便有效。可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線(xiàn)菌的保藏。特別對(duì)難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分浸沒(méi)保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后注入經(jīng)170℃下滅菌1-2h的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時(shí)，應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn)。因?yàn)槟承┚暝谝后w石蠟下生長(zhǎng)還十分明顯，有些菌株如某些假絲酵母還會(huì)同化液體石蠟，也有的對(duì)液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預(yù)防不測(cè)，一般保藏株2～3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分2.4載體法

實(shí)驗(yàn)原理：使生長(zhǎng)合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥。常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分操作方法（砂土管保藏法）（1）河砂處理取河砂若干加入鹽酸10%，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來(lái)水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過(guò)篩，棄去粗顆粒，備用。（２）土壤處理取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過(guò)篩，粗顆粒部分丟掉。

(3)砂土混合處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次)，最后烘干。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分2.4

基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)粒基因通常為宿主細(xì)胞生長(zhǎng)非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分不同菌種保藏方法比較本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分細(xì)菌的保藏本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分放線(xiàn)菌菌種的保藏保藏方法主要有：

沙土管法、冷凍干燥法、液氮冷凍法

放線(xiàn)菌菌種的長(zhǎng)期保藏依保藏放線(xiàn)菌的分生孢子為主要方式。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分2.5微生物活力和穩(wěn)定性測(cè)定

所有保藏菌種的方法都必須是長(zhǎng)期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時(shí)定期檢測(cè)菌種活力，以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實(shí)際保藏過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分對(duì)工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來(lái)說(shuō)，建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標(biāo))應(yīng)在保藏后加以檢測(cè)和確定。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測(cè)保藏過(guò)程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下通過(guò)對(duì)高溫下短期活力喪失程度檢測(cè)，可以用來(lái)預(yù)測(cè)嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性。成功的菌種長(zhǎng)期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間后存活百分率(或存活單位)。細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性，以及實(shí)驗(yàn)室中、中試車(chē)間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性，后者極為重要。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分第十節(jié)菌種的衰退與復(fù)壯

在生物進(jìn)化的歷史長(zhǎng)河中，遺傳性的變異是絕對(duì)的，而它的穩(wěn)定性反而是相對(duì)的；退化性的變異是大量的，而進(jìn)化性的變異卻是個(gè)別的。在自然情況下，個(gè)別的適應(yīng)性變異通過(guò)自然選擇就可保存和發(fā)展，最后成為進(jìn)化的方向；在人為條件下，人們也可以通過(guò)人工選擇法去有意識(shí)地篩選出個(gè)別的正變體用于生產(chǎn)實(shí)踐中。相反，如不自覺(jué)、認(rèn)真地去進(jìn)行人工選擇，大量的自發(fā)突變菌株就會(huì)趁機(jī)泛濫，最后導(dǎo)致菌種的衰退（degeneration）。

本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分在長(zhǎng)期接觸菌種的實(shí)際工作人員中，都有這樣的體會(huì)，即如果對(duì)菌種工作長(zhǎng)期放任自流，不搞純化、復(fù)壯（rejuve-nation）和育種，則菌種就會(huì)對(duì)你進(jìn)行“懲罰”，反映到生產(chǎn)上就會(huì)出現(xiàn)持續(xù)的低產(chǎn)、不穩(wěn)產(chǎn)。這說(shuō)明菌種的生產(chǎn)性狀也是不進(jìn)則退的。本文檔共47頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期三\11點(diǎn)6分菌種衰退的表現(xiàn)對(duì)產(chǎn)量性狀來(lái)說(shuō)，菌種的負(fù)變就是衰退。其他原有的典型性狀變得不典型時(shí)，也是衰退。最易覺(jué)察到的是菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變。生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生