顯微注射針的制作

[注射針的制作]注射針是內(nèi)含玻璃細(xì)絲的薄壁毛細(xì)吸管，它可以通過毛細(xì)管虹吸作用進(jìn)行載樣。用拉針儀（SUTTER,P2000laserbasedmicropipettepuller,具體操作程序詳見產(chǎn)品說明書可以把注射針?biāo)交虼怪背断聛肀仨毐ＷC制備的毛細(xì)管可以進(jìn)入拉針儀這樣加熱組件大約在毛細(xì)管的中央位置一般用內(nèi)徑為1.0mm的微電極管為材料制作注射針,微電極管可以買到,它與拉針儀是匹配的另外應(yīng)該對拉針儀的設(shè)置進(jìn)行選擇，使細(xì)絲溫度和扯拉力度(主拉力和次拉力)將處于最佳狀態(tài)具體需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定其最佳設(shè)置待用注射針應(yīng)該用蒸餾水嚴(yán)格清洗以除去殘留炭化物顆粒嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)微電極管在使用前應(yīng)經(jīng)過泡酸泡蒸餾水和硅化的程序,但有人省略了此步也有較好的結(jié)果,經(jīng)拉針儀拉針后就沒法清洗,好的拉針儀是不會殘留炭化物顆粒,若拉成后清洗其針尖很容易斷掉,可用NarishigeJapanmodelPN-30。[持卵管制作]為避免機(jī)械損傷持卵管口應(yīng)該是鈍性末端而且其孔隙有限使受精卵輕輕依附在負(fù)壓管道中這種高度密實(shí)可抵抗密封系統(tǒng)的破損而密封可以減少受精卵注射時的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動持卵管的口部應(yīng)該光滑平整及與其長軸垂直具體制備操作：雙手執(zhí)毛細(xì)玻璃管的兩端將管的中部置酒精燈外焰燒紅至變軟后離開火焰同時雙手外伸將燒軟的部分拉細(xì)用玻璃刀或細(xì)沙輪小心將細(xì)管切開在鏡下觀察切口應(yīng)平齊(如不平齊應(yīng)重新切割)然后于酒精燈火焰底部的藍(lán)焰邊緣處將切口鈍化處理(即將管口于藍(lán)焰邊緣處做短暫灼燒，然后顯微鏡下檢查管口形狀，如此反復(fù)，直至滿意)。如實(shí)驗(yàn)室配有持卵管制作儀，則可在顯微鏡下直接監(jiān)視熱燈絲對持卵管管口灼燒后的形狀及時調(diào)整二者之間的相對位置更易得到滿意的持卵管。持卵管應(yīng)該做調(diào)整，用熔斷儀將其打彎使其末端15度(不同的顯微注射儀度數(shù)可能有差,打彎成25度左右,一般為20-25度)輕微彎曲以方便使用此持卵管為不含細(xì)絲的玻璃顯微鏡下用含刻度目鏡確定持卵管的外徑應(yīng)該為100-140?。持卵管的內(nèi)徑很重要,可用鉑金燈絲灼燒管口,使其內(nèi)徑為30-50?m左右,內(nèi)徑要能吸住受精卵,管（5。[作]1）點(diǎn)燃酒精燈，調(diào)節(jié)火焰到最佳。捏持玻璃毛細(xì)吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋轉(zhuǎn)過火。2）當(dāng)吸管開始變軟，快速撤離火焰，向外急劇扯拉使吸管變長，形成口徑大約200?l的制。3）為做。4）解下(要上)檢管。[作]這約1)大使卵胞精要頭。[備]注在pH如2在持0：1）將2約m液礦于M2溶達(dá)M2溶倒使2。2）覆；定M2溶。3）從用2滌2-3次，調(diào)整實(shí)驗(yàn)用量，將其置于凹玻片的M2溶液中，調(diào)焦使在低倍鏡下清楚地看到受精卵的輪廓并且保證受精卵有足夠空間自由移動用持卵器將卵匯聚到一起移卵時注意不要將氣泡移入，影響操作視野。[顯微注射設(shè)備]顯微注射儀的基本工作原理是運(yùn)用立體倒置相差顯微鏡進(jìn)行觀察監(jiān)測顯微鏡兩側(cè)各置一臺顯微操作儀一側(cè)接持卵管另一側(cè)接注射針可調(diào)節(jié)持卵管或注射針的空間位置持卵管通過塑料管連接一個裝滿礦物油的帶微調(diào)的注射器通過調(diào)節(jié)壓力控制卵的運(yùn)動注射針通過塑料管連接有壓力泵的注射儀將注射時間與壓力固定后進(jìn)行注射操作操作系統(tǒng)有LEICAASTP基因轉(zhuǎn)殖操作系（marites.d）等體程說格。（3）針內(nèi)DNA的裝載把針頭盛射DNA的管通細(xì)虹用入注注的該留在DNA溶液到針小這說明DNA溶液完仔注針距米見凹液最載滿DNA溶液管持固械待。（4）卵注射受的射相量程顯量一致必大復(fù)練可。1）置凹片鏡倍。2）（X時。3）針見A定A。4）見A。定A。5）生。玻。，，卵。6）原。7）針入，法。8）使A中：①。②，，沒易。③換A。④卵射5—0。9）用注。5移（1射1通用7%乙。2，。4）用。圖11所個。當(dāng)所有的卵被負(fù)載后再吸取小量氣體制成小氣泡接著吸取最終容量的工作液氣泡將有利于對壓力進(jìn)行調(diào)節(jié)，更容易使卵移動。5）約5髖浸%側(cè)切口皮膚鈍性分離皮下組織移動皮膚直到腹壁神經(jīng)走行清晰可見這時可看到腹壁下紅色卵巢或淺色卵巢脂肪墊。用眼科鑷捏住腹壁，并作約0.5厘米橫行住暢。6）位。7），。干。8）壺。9）流在，。0）腹。0啃。1。2效。前0應(yīng)。（2止癥導(dǎo)少2處。，持鼠籠溫度。正常體溫的維持可以縮短動物處于麻醉狀態(tài)的時間。手術(shù)后小鼠常規(guī)4-5天觀察一次以確保小鼠處于恢復(fù)中，清醒小鼠應(yīng)活動自如。腹腔手術(shù)后小鼠有發(fā)生腸疝的可能。所以手術(shù)時保持切口盡量小，縫合嚴(yán)密，而組織膠水的正確應(yīng)用可以避免此類并發(fā)癥的發(fā)生。皮膚必須用縫線或不銹剛夾夾閉，手術(shù)后1-2周可拔除。如果動狀態(tài)不，表現(xiàn)厭食，脫水，或