浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論

PlatformTechnologiesofBiology生物技術(shù)平臺的兩根支柱：浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)&單克隆抗體技術(shù)浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)林旭璦副教授

醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論林旭璦：

辦公室:醫(yī)學(xué)院科研C817

電話:88208294

實驗室:科研C804～810

E-mail:浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論關(guān)于考試：

開卷，實驗課結(jié)束前上交（10.26-10.27）

（A4紙張打印試題，手寫答案附后）

10+40+50浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論參考書谷鴻喜，張鳳民，凌虹.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù).北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2012章靜波.組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù).人民衛(wèi)生出版社，2011譚玉珍.實用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù).

高等教育出版社，2010浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論一、緒論

二、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識

培養(yǎng)前準(zhǔn)備/培養(yǎng)基/培養(yǎng)設(shè)備

三、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

培養(yǎng)技術(shù)/培養(yǎng)物的固定、染色/顯微鏡觀察

四、細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問題內(nèi)容浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論組織培養(yǎng)的誕生與發(fā)展簡史

組織培養(yǎng)的優(yōu)缺點

組織培養(yǎng)常用術(shù)語

組織培養(yǎng)的實際意義

細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名緒論浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)

從動物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動生長的過程。B、組織培養(yǎng)將組織塊用機(jī)械方法或酶解法分離成單個細(xì)胞，做成細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細(xì)胞生長，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術(shù)。A、細(xì)胞培養(yǎng)C、器官培養(yǎng)是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個器官在體外存活、生長，并保持其原有結(jié)構(gòu)和功能的培養(yǎng)技術(shù)。浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論一、組織（細(xì)胞）培養(yǎng)發(fā)展史年鑒1878ClaudeBernard:證明一個器官的生理系統(tǒng)在個體死亡以后仍然可以人工維持。

1885WilhelmRoux:在一個生理溶液中維持一塊雞胚的活性并觀察其發(fā)育，從而證實該發(fā)育與雞胚的其他部分無關(guān)。1907RossHarrison:利用凝固的青蛙淋巴液作為培養(yǎng)基，在體外培養(yǎng)青蛙神經(jīng)嵴，維持其活性達(dá)數(shù)星期，并觀察到了神經(jīng)纖維的生長，從而解決了神經(jīng)纖維的來源問題。RossHarrison被人稱為細(xì)胞培養(yǎng)之父。浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論1910Burrows:率先在血漿凝塊中長期培養(yǎng)雞胚細(xì)胞。

1911Lewis:以海水、血清、胚胎提取物、鹽和蛋白胨為原料配制成了第一個人工的細(xì)胞培養(yǎng)液，并觀察到了單層細(xì)胞的有限生長。

1916Rous&Jones:開創(chuàng)用胰酶來收獲貼壁生長的細(xì)胞。

1923-1931Carrel:研制T型培養(yǎng)瓶大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。1927Carrel&Rivera:制造了第一個病毒疫苗——牛痘疫苗。1933Gey:發(fā)明了轉(zhuǎn)管培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)。一、組織（細(xì)胞）培養(yǎng)發(fā)展史年鑒浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論1948Fisher:研制成了第一個化學(xué)成分清楚的細(xì)胞培養(yǎng)液CMRL1006。1952Gey和同事:分離培養(yǎng)了HeLa細(xì)胞。1952Dulbecco:發(fā)明了噬斑法，用長滿的單層細(xì)胞檢測病毒。1954Abercrombie:觀察到了體外培養(yǎng)細(xì)胞接觸抑制的現(xiàn)象。1961Hatflick&Moorhead:發(fā)現(xiàn)人成纖維細(xì)胞在一定的代數(shù)之后會死亡。1965Ham:配制了第一個無血清培養(yǎng)液。1975K?hler&Milstein:成功得到第一個用于單抗生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞株。一、組織（細(xì)胞）培養(yǎng)發(fā)展史年鑒浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論1.研究的對象是活細(xì)胞

能長時間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等二、細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點2.研究條件可以人為控制

選擇對象：均一性、重復(fù)性（類型/性質(zhì)/階段）調(diào)節(jié)條件：化學(xué)、物理、生物等因素條件研究方法：各種研究技術(shù)、記錄方法浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論3.研究的范圍比較廣泛

學(xué)科多：細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等對象廣：各種動物：低等動物--高等動物--人類

一種動物：不同年齡--

不同組織：正?；虍惓＃[瘤--）二、細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點4.研究的費用相對較經(jīng)濟(jì)

可提供大量、同一時期、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實驗對象浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論人工所模擬的條件與體內(nèi)實際情況仍不完全相同。當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中久了，必然發(fā)生變化。1.與體內(nèi)主要不同

相對孤立、單一

缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響

2.主要表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)

分化減弱或不明顯,

細(xì)胞趨向單一化二、細(xì)胞培養(yǎng)的缺點浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論對于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)該把他們視作一種既能保持動物體內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀、結(jié)構(gòu)和功能又具有某些改變的特定的細(xì)胞群體，而不能將之與體內(nèi)的細(xì)胞完全等同。提示浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論三、常用術(shù)語浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論初代培養(yǎng)/原代培養(yǎng)（primaryculture）

從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。初代培養(yǎng)物一旦進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，就成為細(xì)胞系。通常10代以內(nèi)的培養(yǎng)物用作原代培養(yǎng)。--有限細(xì)胞系（finitecellline）生存期有限的細(xì)胞系，不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限。--連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（infinitecellline）獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，能連續(xù)傳代。傳代培養(yǎng)（sub-culture）

不論是否稀釋，在體外培養(yǎng)條件下，將細(xì)胞從一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)器皿。浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論貼壁培養(yǎng)（anchorage-dependentculture）

細(xì)胞或培養(yǎng)物只有貼附于不起化學(xué)作用的物體（玻璃或塑料等無活性物體）的表面時才能生長、生存或維持功能。

不能表明細(xì)胞屬于正?；驉盒赞D(zhuǎn)化懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）

細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖的一種培養(yǎng)方式。

淋巴細(xì)胞、血液腫瘤細(xì)胞等浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論細(xì)胞株（cellstrain）

通過篩選或克隆化從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞。這些特性（有一定的標(biāo)記染色體、特殊的抗原性等）在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。

--有限細(xì)胞株（finitecellline）

生存期有限的細(xì)胞株。不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限--連續(xù)細(xì)胞株或無限細(xì)胞株（infinitecellline）

已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞株。能連續(xù)傳代。亞株（substrain）

由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀有一定不同的細(xì)胞群浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論二倍體細(xì)胞系或株

細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍體細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75％以上）的細(xì)胞群。在正常情況下具有限生命期，屬有限細(xì)胞系。

隨供體年齡和組織來源的不同，壽命長短各異。---人胚肺成纖維細(xì)胞可傳40-60代---人胚腎細(xì)胞只有8-10代---人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞15-30代為保持二倍體細(xì)胞能長期被利用，一般在初代或2-5代即大量凍存作為原種（stockcells），用時再進(jìn)行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細(xì)胞的衰老。假二倍體：僅數(shù)目相同，而核型不同，即染色體形態(tài)有改變者。浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論遺傳缺陷細(xì)胞系或株

從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺陷細(xì)胞。

這類細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。腫瘤細(xì)胞系或株

是現(xiàn)有細(xì)胞系或細(xì)胞株中最多的一類，我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論細(xì)胞凋亡（apoptosis）

細(xì)胞內(nèi)死亡程序的開啟而導(dǎo)致細(xì)胞自殺的過程。

與機(jī)體正常發(fā)育、形態(tài)形成、消除多余細(xì)胞等生理過程密切相關(guān)。

主要形態(tài)特征為細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)聚集與周邊化，以及凋亡小體的形成。ATCC（Americantypeculturecollection）

美國模式培養(yǎng)物收集中心/美國菌種保藏中心。

除收集細(xì)菌、病毒外，還保藏有大量的細(xì)胞株（系）。浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論體外轉(zhuǎn)化（invitrotransformation）

細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生與原代細(xì)胞形態(tài)、抗原、增殖或其它特性的可遺傳的變化，但不具有致瘤性。匯合（confluence）

在瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞彼此匯合形成單層。細(xì)胞融合（cellfusion）

在體外培養(yǎng)條件下，經(jīng)化學(xué)試劑（PEG）、病毒（滅活仙臺病毒）或物理方法（電脈沖）誘發(fā)，使不同種的體細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交細(xì)胞。浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論細(xì)胞周期（cellcycle）

細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束開始至本次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時相過程。DNA合成期（S期）、有絲分裂期（M期）、有絲分裂完成至DNA合成開始的間隙期（G1期）、DNA復(fù)制結(jié)束至有絲分裂開始的間隙期（G2期）。群體倍增時間（populationdoublingtime）

在對數(shù)生長期進(jìn)行計算的細(xì)胞增加一倍所需的時間。細(xì)胞代時（cellgenerationtime）

單個細(xì)胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論群體密度（populationdensity）

培養(yǎng)器皿內(nèi)，每單位面積或體積中的細(xì)胞數(shù)，多用細(xì)胞數(shù)/cm2表示。接觸抑制（contactinhibition）

當(dāng)一個貼壁生長的體外正常細(xì)胞生長至與另一個細(xì)胞表面相互接觸時，便停止了分裂增殖，雖然相互緊密接觸，但不形成交叉重疊生長，也不再進(jìn)入S期。飽和密度（saturationdensity）

在特定條件下，培養(yǎng)皿內(nèi)能達(dá)到的最高細(xì)胞數(shù)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后細(xì)胞群體停止繁殖，貼壁培養(yǎng)：細(xì)胞數(shù)/cm2；懸浮培養(yǎng)：細(xì)胞數(shù)/cm3。浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論分子生物學(xué)生物工程臨床診斷和治療生物制品藥物開發(fā)四、細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)實意義浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論單克隆抗體制備過程浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論多莉克隆猴浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論對已建成的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱；細(xì)胞的命名無嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫字或代號表示。但不論什么形式，均不宜太長，以便記憶和了解

HeLa：為供體患者的性名(來源于宮頸癌)CHO：中國地鼠卵巢細(xì)胞(ChineseHamsterOvary)宮—743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3；美國國立衛(wèi)生研究所(NationalInstituteofHealth)建立,每3天傳代一次，每次接種3×106cell/ml。五、細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論已建立細(xì)胞系或株的簽定、管理和使用培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等。凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱。細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性。培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱(一般要求不含抗生素)，血清來源和含量。ATCC（Americantypeculturecollection）入庫細(xì)胞要求檢測項目如下：浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)-緒論已建立細(xì)胞系或株的簽定、管理和使用細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等。核型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無。無污染測驗：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等。物種檢測：檢測同功酶，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有否交叉污染。