研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)第一節(jié)基因的功能一、人的先天代謝缺陷(inbornerrorsinmetabolism

)20世紀(jì)初英國(guó)醫(yī)生Garrod發(fā)現(xiàn),其與基因功能異常有關(guān)。1．黑尿癥：正常人具有尿黑酸氧化酶，能使尿黑酸轉(zhuǎn)化為乙酰醋酸，最后分解為CO2和水。黑尿癥患者無(wú)尿黑酸氧化酶。尿液中含有尿黑酸，排出經(jīng)氧化后變黑。黑尿病基因?yàn)閍，患者基因型aa，正常人為AA或Aa。2．苯丙酮尿癥：個(gè)體不能形成苯丙氨酸羥化酶，使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酪氨酸。大量苯丙氨酸積累進(jìn)一步引起下列反應(yīng)：苯丙氨酸自發(fā)轉(zhuǎn)化為一種有毒物質(zhì)苯丙酮酸，隨尿排出3.過(guò)量苯丙氨酸積累，損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響智力發(fā)育;血液中苯丙氨酸積累抑制了酪氨酸的代謝。后者是黑色素的前體，造成白化病，無(wú)正常的酪氨酸酶。編碼酪氨酸酶的基因?yàn)镃。正常人為CC或Cc，白化病人為cc。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)1909年，Garrod發(fā)表“先天性代謝異?！崩纾旱鞍踪|(zhì)蛋白質(zhì)

苯丙氨酸酪氨酸二羥苯丙氨酸↓↓對(duì)羥苯丙酮酸黑色素

↓尿黑酸↓乙酰醋酸↓

CO2+H2O↓苯丙酮酸(苯丙酮尿癥)(黑尿癥)(白化病)研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)結(jié)論：先天性代謝缺陷是由于一種酶的缺失造成，由一隱性基因控制?；虻淖饔檬菦Q定某種酶，從而控制代謝途徑并控制某一性狀。問(wèn)題：基因是如何控制代謝途徑或生化反應(yīng)的呢？二、“一個(gè)基因一種酶”學(xué)說(shuō)四十年代，Beadle和Tatum對(duì)鏈孢霉的研究進(jìn)一步闡明了基因的作用。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)1.假設(shè)：某一生物合成途徑如下。起始物：12345終產(chǎn)物ABCD基因a決定酶A，如果基因b缺失：12345產(chǎn)物abcd基因ABCD酶結(jié)果：產(chǎn)物2轉(zhuǎn)化為3的反應(yīng)不能進(jìn)行。即在物質(zhì)2上被阻斷。如加入3或4，可以得到終產(chǎn)物5。如加入更多的1，也不可能合成終產(chǎn)物5。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)2.闡明上述原理的例子分析假定有一些突變體需要物質(zhì)G才能生長(zhǎng)，生物合成途徑中A—E的所有成份是已知的，試驗(yàn)每種成份維持突變體生長(zhǎng)的能力，結(jié)果如下：

研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)EACBDG問(wèn)（1）：在這一途徑中，A—E和G的順序？思考：能使大多數(shù)突變體生長(zhǎng)的物質(zhì)是最后生成的，而最早生成的物質(zhì)能維持突變體生長(zhǎng)的數(shù)目是最少的，可以得到以下順序：研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)GDBCAE思考：

E不能滿足E—A之間受阻的突變體生長(zhǎng)的要求，而其它物質(zhì)都能滿足E→A之間突變體生長(zhǎng)的要求。從表中可知突變體5一定是由于E→A轉(zhuǎn)化受阻造成。同樣，E或A不能使突變體4生長(zhǎng)，其它物質(zhì)都能使其生長(zhǎng)，因此4肯定是由于A→C的轉(zhuǎn)化中受阻造成。最后可得：?jiǎn)枺?）：上述突變體是由于途徑中那一步受阻造成的？54213研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)3．Beadle和Tatum實(shí)驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotrophs）：不能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，只能在補(bǔ)加了特定營(yíng)養(yǎng)物之后才能生長(zhǎng)的突變體。有一組需要精氨酸才能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的鏈孢霉突變體，它們對(duì)鳥(niǎo)氨酸和瓜氨酸的反應(yīng)如下：研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

Beadle等提出了鏈孢霉精氨酸合成的生化模型：

酶X酶Y酶Z

前體鳥(niǎo)氨酸瓜氨酸精氨酸

Beadle等將不同的突變體定位于相應(yīng)的合成步驟上

———arg1———arg2———arg3———基因↓↓↓

XYZ酶

前體鳥(niǎo)氨酸瓜氨酸精氨酸研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)該模型已成為“一個(gè)基因一種酶”的理論要點(diǎn)：

細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)由一系列不同反應(yīng)步驟組成；每一步反應(yīng)都有一種特異性酶催化；每一種酶由一個(gè)基因控制。該理論的進(jìn)一步發(fā)展：“一個(gè)基因一種蛋白”,“一個(gè)基因一條多肽”。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

一條肽鏈中氨基酸的線性序列稱為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的三維構(gòu)型決定于氨基酸的序列即一級(jí)結(jié)構(gòu)，基因是通過(guò)控制蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)決定酶的功能的。

第二節(jié)基因與蛋白質(zhì)的相互關(guān)系研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

兩個(gè)氨基酸之間形成肽鍵的反應(yīng)。

血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)序列分析Sanger測(cè)定多肽序列的方法：蛋白質(zhì)指紋（fingerprints）：蛋白質(zhì)經(jīng)水解后形成較小的片段，經(jīng)層析法分離和染色后，不同大小的片段以特定的位置出現(xiàn)。不同的水解酶作用后產(chǎn)生不同的指紋。Sanger證明：某一特定蛋白質(zhì)(胰島素)的氨基酸序列是特異性的。三、基因突變與蛋白質(zhì)變化的關(guān)系

1957年，VernonIngram對(duì)正常人的HbA和鐮形細(xì)胞貧血癥的基因突變純合體的HbS作比較研究。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)正常人的血紅蛋白（hemoglobin,Hb）由兩條α鏈和兩條β鏈組成，α鏈有141個(gè)aa，β鏈有146個(gè)aa。HbA和HbS的指紋只有一個(gè)位置上有區(qū)別，進(jìn)一步對(duì)不同指紋部位作序列分析發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)aa的差異：

1234567……

正常HbA：纈—組—亮—蘇—脯—谷—谷——……

鐮形HbA：纈—組—亮—蘇—脯—纈—谷——……正常紅細(xì)胞鐮形紅細(xì)胞研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)InvestigationofhemoglobinderivedfromHbAHbAandHbSHbS.individualsusingelectrophoresis,fingerprinting,andaminoacidanalysis.結(jié)論：在β鏈上第6位的纈氨酸代替了正常的谷氨酸，造成缺陷性血紅蛋白。Ingram的研究結(jié)果說(shuō)明：通過(guò)遺傳分析確定的基因突變可以與一個(gè)蛋白質(zhì)的aa序列的變化相連系，基因決定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)四、基因與蛋白質(zhì)的線性對(duì)應(yīng)1967年，CharlesYanofsky對(duì)E.coli色氨酸合成酶的研究證明基因變化與蛋白質(zhì)變化之間有線性對(duì)應(yīng)。色氨酸合成酶由A、B兩條多肽組成，trpA基因和trpB基因控制各自多肽的合成。在trpA基因圖中其突變點(diǎn)的序列與多肽A的氨基酸變化的位置有一種精確的對(duì)應(yīng)關(guān)系?；虻暮塑账峋€性序列決定蛋白質(zhì)的aa線性序列，稱為共線性關(guān)系（Co-linearity）。在E.coli色氨酸合成酶trpA基因其突變點(diǎn)的序列與多肽A的氨基酸變化位置有一種精確的對(duì)應(yīng)關(guān)系。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)Nucleotide/AminoAcidColinearity研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

五、“一個(gè)基因一種酶”學(xué)說(shuō)對(duì)經(jīng)典遺傳學(xué)的某些解釋1．對(duì)遺傳比例和顯性的解釋：豌豆花色素的遺傳，雙因子雜種F2的比為9：7。解釋：在最終產(chǎn)生紫花色素的生物合成途徑中有兩個(gè)白色前體。P：（白）AAbb×aaBB（白）↓F1：全部AaBb（紫色）↓F2：A

B

A

bbaaB

aabb

紫9白3白3白1

基因A基因B↓↓

酶A酶B↓↓

前體1前體2紫花色素

A

B

A

bbaaB

aabb

紫9白3白3白1

等位基因A等位基因a

酶A無(wú)功能的酶

前體X產(chǎn)物Y（產(chǎn)生Y表型）雜合體Aa表現(xiàn)為Y表型。A對(duì)a是顯性。顯性表示某一酶的功能正常，隱性表示該酶缺少活性。一個(gè)雜合體Aa具有產(chǎn)生正常功能酶的顯性等位基因。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)2．臨界值模型只有當(dāng)產(chǎn)物Y的濃度超過(guò)某一臨界值時(shí)才能產(chǎn)生表型Y。純合體AA比雜合體Aa產(chǎn)生更多的酶A。因此就會(huì)產(chǎn)生更多的產(chǎn)物Y。雜合體Aa的表型取決于它的Y產(chǎn)物量與臨界的關(guān)系。A2A2A1A1B1B1

B1B2

A1A2B2B2表型Y表型X產(chǎn)物Y濃度研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)無(wú)臨界值時(shí)，雜合體Aa為中間表型，這是一種不完全顯性。與產(chǎn)物濃度相稱的表型

產(chǎn)物Y濃度

酶濃度C1C1C1C2C2C2研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)第三節(jié)遺傳單位的精細(xì)結(jié)構(gòu)基因概念的發(fā)展遺傳因子（孟德?tīng)枺颍↗ohannsen,1909）染色體是基因的載體（摩爾根，《基因論》1926） 念珠學(xué)說(shuō)——

三位一體DNA是遺傳物質(zhì)（Griffith,1928,Avery,1944）基因是有功能的DNA片段一個(gè)基因一個(gè)酶——DNA雙螺旋模型——中心法則——順?lè)醋印蛔冏印亟M子：核苷酸操縱子模型跳躍基因和斷裂基因研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)1957年Benzer用大腸桿菌T4噬菌體為材料，在DNA分子結(jié)構(gòu)的水平上，分析了基因內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)，提出了順?lè)醋拥母拍?。研究基因精?xì)結(jié)構(gòu)

T4噬菌體的結(jié)構(gòu)ThestructureofbacteriophageT4includinganicosahedralheadfilledwithDNA,atailconsistingofacollar,tubesheath,baseplate,andtailfibers.研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)一、細(xì)菌噬菌體的生活周期LifecycleofbacteriophageT4.

研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)二、T4噬菌體的rII系統(tǒng)rII型突變體：快速溶菌突變體(rapidlysis)，與野生型rII+相比具有不同的宿主范圍。rII不能在E.coliK上生長(zhǎng)提供了一種選擇手段。E.coilB是rII的許可性宿主（permissivehost），

E.coliK（λ）是rII的非許可性宿主（nonpermissivehost）。嗜菌斑形態(tài)的突變體寄主范圍的突變體條件致死突變體研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)三、噬菌體的雜交和選擇用兩種不同的rII突變體感染同一細(xì)菌E.coliB，一旦進(jìn)入細(xì)胞，T4之間的DNA就發(fā)生重組，從而產(chǎn)生重組類型的噬菌體。然后感染E.coliK，野生型重組體的數(shù)目等于在K上的pfu/ml的數(shù)（plagueformingunit）。優(yōu)點(diǎn)：用rII系統(tǒng)和兩個(gè)宿主，不需要篩選大量的噬菌斑就能選擇到極少發(fā)生的重組體。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)Benzer的重組測(cè)驗(yàn)r47+侵染大腸桿菌B菌株同時(shí)侵染r+104大腸桿菌B菌株大腸桿菌K菌株侵染親組合：r47r+、r+r10重組合：r+r+、r47r104重組合：r+r+

共525共370研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)2×rII+噬菌體數(shù)

總噬菌斑數(shù)

在B上的噬菌斑數(shù)

＝2×在K上生長(zhǎng)的噬菌體數(shù)×100%

＝重組率四、基因內(nèi)重組(IntragenicRecombination)研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)利用這種方法測(cè)得最小重組率的意義最小測(cè)得重組率=0.02%=0.02cMT4噬菌體圖距=1500cM(遺傳重組測(cè)得)T4噬菌體1.8105bp(生物化學(xué)測(cè)得)回頭看作圖的精度：0.02cM=2-3bp=[1.8105bp/1500cM]

T4rII位點(diǎn)基因內(nèi)重組的選擇：rII不能在K上生長(zhǎng)，當(dāng)二個(gè)帶有rII不同等位基因的T4感染同一B株后，其某些后代能在K上生長(zhǎng)，即已成為rII。結(jié)果說(shuō)明在一個(gè)基因內(nèi)發(fā)生了重組，而不是在基因間?；蚩煞郑貉芯炕蚓?xì)結(jié)構(gòu)根據(jù)重組率所得基因圖：

rII1rII7rII4rII5rII2rII8rII3rII6

___|_____|_____|____|_____|____|_____|_____|______它們的圖距就是rII+的重組率?！駌II基因內(nèi)重組說(shuō)明，基因是可以分割重組的，它由更小的單位組成，Benzer稱其為重組子recon，重組可以發(fā)生在重組子之間，但不能發(fā)生在其內(nèi)部。因此，重組子(而不是基因)是重組的單位，基因是重組子完整的線性序列，一對(duì)核苷酸是重組的最小單位。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)第四節(jié)突變位點(diǎn)分析

基因內(nèi)發(fā)生重組有助于構(gòu)建詳細(xì)的基因圖，由各種等位基因突變體雜交發(fā)生基因重組的相對(duì)頻率能揭示出基因內(nèi)突變位點(diǎn)的順序和相對(duì)位置。一、缺失突變體（deletionmutants）

是由于DNA上消除了某個(gè)片段所引起的突變。在以缺失突變?yōu)楸尘暗闹亟M試驗(yàn)中，突變不可能恢復(fù)到野生型。因?yàn)楹湍莻€(gè)特定突變體相對(duì)應(yīng)的野生型區(qū)段的DNA已不復(fù)存在。缺失和真正的點(diǎn)突變的區(qū)別：?jiǎn)蝹€(gè)位點(diǎn)——多個(gè)位點(diǎn)可以回復(fù)——不可回復(fù)可以重組——不可重組研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

二、缺失作圖deletionmapping

Benzer利用在rII區(qū)域中含有短的缺失的特殊突變體來(lái)定位其它新的突變位點(diǎn)。

1．原理：假定一個(gè)由12個(gè)突變位點(diǎn)組成的基因圖：

123456789101112

如：有一特殊突變體D1，當(dāng)它分別與帶有突變點(diǎn)1、2、3、4、5、6、7或8的突變體雜交時(shí)不能獲得rII+重組體，那么D1就是缺失1－8位點(diǎn)的突變體：

123456789101112缺失區(qū)研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)1234缺失區(qū)D1D2ⅠⅡⅢ有另一突變體D2，當(dāng)它與5、6、7、8、9、10、11或12突變位點(diǎn)的突變體雜交時(shí)不能獲得rII+重組體。即D2就是缺失5－12的突變體。根據(jù)重疊缺失區(qū)，可將基因分成三個(gè)區(qū)域研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

2．如何定位新的突變位點(diǎn)？

（1）當(dāng)與D1雜交能獲得rII+重組體，與D2雜交卻不能，該突變體的突變位點(diǎn)位于III區(qū)；研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)（2）當(dāng)與D2雜交時(shí)能夠，但與D1雜交時(shí)不能獲得rII+重組體，該突變位于I區(qū)；（3）與D1和D2雜交都不能得到rII+重組體，其突變位點(diǎn)位于II區(qū)。研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

雜交能否獲得rII+？研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

（4）缺失突變體之間也可以雜交從而象點(diǎn)突變那樣定位，如果雜交得不到rII+重組體，那缺失區(qū)就是重疊的。例如有一缺失圖：研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

利用上述缺失圖可將新的突變定位。思考：下圖表示T4rIIA順?lè)醋又?個(gè)缺失突變體的缺失圖。

1

2

3

4

現(xiàn)有在rIIA中4個(gè)點(diǎn)突變體a－d，分別試驗(yàn)它們與4種缺失突變體雜交獲得rII+的能力，結(jié)果如上表。問(wèn)：4種點(diǎn)突變的順序是怎樣排列的？

a b c d1 + + + +2 + + + －3 + － + －4 － － + － 研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)GoodMorning!研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)思考題：1.有一組噬菌體缺失突變體（1—5），成對(duì)相互雜交得到下列結(jié)果（“+”表示能獲得rII+重組體，“﹣”表示不能）。1234512345

－+－+－+－++－

－+－－－++－－+

－－－+－根據(jù)上述結(jié)果畫(huà)出5個(gè)缺失突變體的缺失圖。用線條表示缺失區(qū)域。

研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)12345研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)2．trp1、trp2、trp3和trp4突變體，為鏈孢酶四種不同的基因突變體，并都是色氨酸缺陷型。trp1：在加有A、B、C三種相關(guān)物質(zhì)或色氨酸時(shí)能生長(zhǎng)；trp2：在加有C或色氨酸時(shí)能生長(zhǎng)；trp3：在加有B、C或色氨酸時(shí)能生長(zhǎng)；trp4只在加有色氨酸時(shí)才能生長(zhǎng)。試問(wèn)色氨酸的生物合成途徑和相應(yīng)基因的控制位點(diǎn)？研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

第五節(jié)互補(bǔ)作用互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)又稱等位性測(cè)驗(yàn)：考察兩個(gè)突變型有無(wú)互補(bǔ)作用的測(cè)驗(yàn)。非等位基因一般都有互補(bǔ)作用；不能互補(bǔ)的兩個(gè)基因可初步斷定為等位基因。原理：各個(gè)突變體單獨(dú)感染大腸桿菌K（λ）都不會(huì)產(chǎn)生嗜菌斑，而將不同突變體兩兩混合后感染之，則有功能互補(bǔ)的突變體可以產(chǎn)生嗜菌斑，不能互補(bǔ)的則不產(chǎn)生嗜菌斑。從而可以確定這兩種噬菌體是否控制相同的不同的遺傳功能。

一、原理和方法研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)方法——斑點(diǎn)測(cè)試法組合1組合3組合2組合4組合5組合6組合7組合8研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)

突變體1突變體2大腸桿菌K(λ)混合感染rIIArIIBrIIArIIBrIIArIIBA群B群互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)圖解研究基因精細(xì)結(jié)構(gòu)不同的rII突變體可以分成兩類