免疫沉淀試驗(yàn)

關(guān)于免疫沉淀試驗(yàn)第1頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

教學(xué)目的掌握：液相內(nèi)沉淀試驗(yàn)、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)原理熟悉：沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)、免疫電泳技術(shù)、沉淀反應(yīng)的應(yīng)用第2頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

一、基本原理免疫沉淀反應(yīng)（immunoprecipitationreaction）指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。第一節(jié)免疫沉淀試驗(yàn)的基本原理第3頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三形成肉眼可見(jiàn)的大的免疫復(fù)合物。第一階段第二階段沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見(jiàn)第4頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三環(huán)狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)免疫濁度測(cè)定免疫擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電泳技術(shù)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)二、免疫沉淀試驗(yàn)的分類(lèi)第5頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.階段性2.特異性3.抗原性質(zhì)：可溶性4.抗體的選擇：2價(jià)

三、免疫沉淀試驗(yàn)的特點(diǎn)第6頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第二節(jié)液體免疫沉淀試驗(yàn)第7頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、絮狀免疫沉淀試驗(yàn)絮狀免疫沉淀試驗(yàn)是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見(jiàn)的絮狀沉淀物。第二節(jié)液體免疫沉淀試驗(yàn)第8頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：抗原抗體最適比例一、絮狀免疫沉淀試驗(yàn)第9頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖絮狀沉示意圖淀AgAbAg第10頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三最適比方陣測(cè)定法第11頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

原理：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在增濁劑中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。

二、免疫濁度測(cè)定第12頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)便快速，易于自動(dòng)化敏感度高精確度高無(wú)放射性核素污染第13頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.根據(jù)反應(yīng)的時(shí)間和反應(yīng)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)分為速率比濁法終點(diǎn)比濁法2.根據(jù)檢測(cè)儀器的位置及光信號(hào)性質(zhì)分為透射免疫比濁法散射免疫比濁法3.免疫膠乳比濁法分類(lèi)：第14頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

透射比濁試驗(yàn)和散射比濁試驗(yàn)光路檢測(cè)器A檢測(cè)器BIC

I0

Iθ

Iθ

透射比濁試驗(yàn)

散射比濁試驗(yàn)當(dāng)復(fù)合物＜3×106dal，I≈Iθ;θ＜90°，散射光的量代表IC的量。第15頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三（1）抗原抗體的比例：反應(yīng)體系保持抗體過(guò)量（2）抗體的質(zhì)量：特異性強(qiáng)，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，并使用R型抗體（3）抗原抗體反應(yīng)液的環(huán)境：最適PH為6.5-8.5（4）增濁劑補(bǔ)充：免疫濁度測(cè)定影響因素第16頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三（1）抗原抗體的比例第17頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

在抗體過(guò)量的反應(yīng)體系中,抗原量的遞增與比濁定量成正比,當(dāng)抗原抗體比例合適時(shí)反應(yīng)達(dá)峰值,而當(dāng)抗原過(guò)量時(shí),形成的免疫復(fù)合物分子小,濁度反而下降的一個(gè)拋物曲線。海德堡曲線第18頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三（2）抗體的質(zhì)量抗體的特異性抗體的效價(jià)(>1:20)抗體的親和力R型和H型抗體（R型）第19頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三（3）抗原抗體反應(yīng)的環(huán)境最適PH為：6.5-8.5離子強(qiáng)度大，IC形成快離子種類(lèi)的影響，常用磷酸鹽緩沖液（4）增濁劑PEG(6000—8000)濃度4%吐溫-20第20頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.抗血清中有非特異性的交叉反應(yīng)性雜抗體成分2.增濁劑濃度和反應(yīng)時(shí)間掌握不當(dāng)3.樣品本身的濁度處理不當(dāng)4.試劑污染變質(zhì)5.比色杯不夠清潔偽濁度形成的原因第21頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第三節(jié)凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗(yàn)第22頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第三節(jié)凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗(yàn)第23頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢?jiàn)的沉淀線或沉淀環(huán)。

原理第24頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三反應(yīng)介質(zhì)：凝膠凝膠的特點(diǎn)：1、固相的液體2、多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)3、Ag-Ab復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)在凝膠中第25頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三原理：抗體與待測(cè)的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)。技術(shù)要點(diǎn)：1.制板2.打孔3.加樣4.擴(kuò)散

5.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量試驗(yàn)一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第26頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三抗體+瓊脂沉淀環(huán)抗原傾注平板打孔加樣放置37℃

24～48h觀察沉淀環(huán)一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第27頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第28頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

T1為16-24h；T2為24-48h；T3為48h以上,可見(jiàn)T3為直線，T1為反拋物線

t1為16-24h；t2為24-48h；t3為48h以上,可見(jiàn)t1為直線，t3為反拋物線Mancini曲線Fahey曲線第29頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三待檢蛋白質(zhì)抗原須具備的條件僅針對(duì)某待測(cè)抗原的單價(jià)特異性抗血清已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)品含量在1.25g/ml以上第30頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三單向擴(kuò)散試驗(yàn)上排為5個(gè)不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第31頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三應(yīng)用IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白的檢測(cè)第32頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三技術(shù)要點(diǎn)：

1.制板

2.打孔

3.加樣

4.擴(kuò)散二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第33頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第34頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第35頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.判斷抗原或抗體的存在以及估計(jì)相對(duì)含量2.分析抗原或抗體相對(duì)分子量二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第36頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三3.分析抗原的性質(zhì)二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第37頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第38頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三4.滴定抗體的效價(jià)5.鑒定抗原或抗體純度二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第39頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

應(yīng)用

1.AFP檢測(cè)的最早方法

2.血清中含量較高的酶類(lèi)、細(xì)菌病毒感染后血清中產(chǎn)生的抗體的檢測(cè)第40頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、免疫電泳技術(shù)第41頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

優(yōu)點(diǎn)：

1.加快反應(yīng)的速度。

2.提高了靈敏度。

3.增加了分辨率。電泳分析＋沉淀反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性電泳技術(shù)的高分辨率、快速、微量三、免疫電泳技術(shù)第42頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三電泳（electrophoresis）：在外加電場(chǎng)的作用下帶電顆粒向著其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。

第43頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三電泳遷移率：定義：同一電場(chǎng)條件下，各種帶電粒子在單位時(shí)間內(nèi)移動(dòng)的距離。M=cm2/VS影響泳動(dòng)的速度的因素:

本身凈電荷量、顆粒大小、形狀電場(chǎng)強(qiáng)度溶液pH值溶液離子強(qiáng)度電滲第44頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三電滲：電場(chǎng)中液體相對(duì)于固體的運(yùn)動(dòng)

①載體的性質(zhì)

②緩沖液的離子強(qiáng)度

③電泳時(shí)的電壓第45頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三電滲方向與樣品運(yùn)動(dòng)方向一致：樣品遷移率加快電滲方向與樣品運(yùn)動(dòng)方向不一致：樣品遷移率降低，甚至倒退

第46頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三電泳載體：瓊脂瓊脂糖凝膠

常用濃度：0.8%-1.0%

特點(diǎn):雜質(zhì)少、接近電中性，常溫易凝固，色澤透明、質(zhì)地均勻、富有彈性。第47頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)：

--NH2

+H2O

--NH3++OH---COOH--COO-+H+

兩性離子pH=pI電中性，無(wú)電泳移動(dòng)性pH<pI酸性溶液帶正離子，向陰極泳動(dòng)pH>pI堿性溶液帶負(fù)離子，向陽(yáng)極泳動(dòng)第48頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三原理：雙向擴(kuò)散+電泳實(shí)質(zhì)上是定向加速度的免疫雙擴(kuò)散技術(shù)比雙向擴(kuò)散試驗(yàn)靈敏度提高8～16倍（一）對(duì)流免疫電泳第49頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三通電－蛋白質(zhì)抗原常帶較強(qiáng)的負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)抗體球蛋白帶負(fù)電荷較少，籍電滲作用向負(fù)極泳動(dòng)

＋（一）對(duì)流免疫電泳第50頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第51頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三結(jié)果分析：無(wú)沉淀線出現(xiàn)則表明無(wú)相應(yīng)的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中間，說(shuō)明兩者比例較適合。（一）對(duì)流免疫電泳第52頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三技術(shù)評(píng)價(jià)：

1.簡(jiǎn)便、快速,敏感度較雙擴(kuò)提高8-16倍，可測(cè)蛋白質(zhì)濃度達(dá)ug/ml.2.要求抗原、抗體比例嚴(yán)格3.不適宜抗原抗體都是球蛋白的檢測(cè)第53頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時(shí)，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。

單向免疫擴(kuò)散＋電泳,定量檢測(cè)技術(shù)（二）火箭免疫電泳第54頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測(cè)樣品，樣品孔放負(fù)極側(cè)，6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)樣品濃度。技術(shù)要點(diǎn)（二）火箭免疫電泳第55頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

火箭免疫電泳圖①②③④為標(biāo)準(zhǔn)抗原；⑤⑥為標(biāo)本-+（二）火箭免疫電泳示意圖第56頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三結(jié)果判定：

1、定性：直接觀察、染色2、定量：根據(jù)峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3、為提高靈敏度，可加入少量125I標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見(jiàn)的火箭峰第57頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三原理：區(qū)帶電泳＋雙向擴(kuò)散1、將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見(jiàn)的若干區(qū)帶2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進(jìn)行雙向擴(kuò)散（三）免疫電泳第58頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三根據(jù)各蛋白所處的電泳位置,可分為:白蛋白區(qū)、球蛋白區(qū)、1區(qū)、2區(qū)、區(qū)、區(qū)

+--ALB12白蛋白抗胰蛋白酶觸珠蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白IgG前白蛋白酸糖蛋白銅藍(lán)蛋白C3aC3bCRP1脂蛋白抗糜蛋白酶巨球蛋白第59頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第60頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第61頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.純化抗原和抗體成分的分析2.正常及異常免疫球蛋白的識(shí)別與鑒定應(yīng)用免疫電泳第62頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三-+（三）免疫電泳示意圖第63頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第64頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三技術(shù)評(píng)價(jià)：

1.分辨率較高2.僅定性3.擴(kuò)散時(shí)間長(zhǎng)，影響因素多，結(jié)果較難分析4.目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識(shí)別與鑒定。第65頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后，可對(duì)各類(lèi)免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型原理區(qū)帶電泳＋沉淀反應(yīng)（四）免疫固定電泳第66頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三

左圖為IgGκ型,中圖為IgGλ型，右為正常

SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ（四）免疫固定電泳示意圖第67頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三原理：

待檢蛋白電泳

固定劑及各類(lèi)抗血清加于凝膠表面的泳道抗原與對(duì)應(yīng)抗體反應(yīng)沉淀漂洗染色某一抗原的存在?

第68頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三分辨率強(qiáng)，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時(shí)，結(jié)果易于分析。應(yīng)用最常用于M蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質(zhì)的檢測(cè)與κ、λ分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測(cè)與分型。優(yōu)點(diǎn)（四）免疫固定電泳第69頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三應(yīng)用:M蛋白的鑒定和分型第70頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三（五）交叉免疫電泳（六）自動(dòng)化免疫電泳第71頁(yè)，講稿共78頁(yè)，2023年5月2日，星期三第四節(jié)免疫沉淀試驗(yàn)的臨床應(yīng)用

免疫濁