新鮮與保存人羊膜超微結(jié)構(gòu)初步觀察

新鮮與保存人羊膜超微結(jié)構(gòu)初步觀察【摘要】目的：對(duì)新鮮和保存人羊膜的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，從形態(tài)學(xué)角度探討人羊膜超微結(jié)構(gòu)與其眼表重建之間的關(guān)系。方法：采用掃描電鏡、透射電鏡和光鏡分別對(duì)新鮮和低溫純甘油中保存6個(gè)月人羊膜的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果：電鏡下保存羊膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整，分泌顆粒與細(xì)胞間連接、微絨毛和微皺褶結(jié)構(gòu)均存在。光鏡下保存羊膜仍維持完整立方上皮層，細(xì)胞形態(tài)整齊，兩者基底膜完整。結(jié)論：新鮮和保存人羊膜均具有完整的上皮細(xì)胞層和基底膜，從形態(tài)學(xué)角度推測(cè)羊膜重建眼表的作用與此有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】羊膜；超微結(jié)構(gòu)；眼表重建

[Abstract]Objective：Toobservetheultrastructureoffreshandpreservedhumanamnioticmembraneandresearchfortherelationshipbetweentheultrastructureofhumanamnioticmembraneandocularsurfacereconstructionfrommorphologicviewpoint.Methods：Transmissionelectronmicroscope,scanningelectronmicroscopeandopticalmicroscopewereusedtoobservetheultrastructureoffreshandcryopreservedhumanamnioticmembranesfor6monthsinpureglycerin.Results：Preservedhumanamnioticmembranehadthesamestuctureofregularandintactepithelialcellsasthefreshone.Theirconformation,arrangement,microvillimicroplicae,celljunctionsandsecretedgrainsstillexistedeventhoughtheyhadbeencryopreservedfor6months.Conclusion：Thehumanamnioticmembranecryopreservedat-80℃for6monthsinpureglycerinhasthesameultrastructureasthefreshone.

[Keywords]Amnion；Ultrastructure；Ocularsurfacereconstruction自1995年Kim和Tseng首次報(bào)道保存人羊膜移植重建實(shí)驗(yàn)性兔眼眼表結(jié)構(gòu)獲得成功以來(lái)[1]，人羊膜移植已被大量應(yīng)用于眼表疾病的臨床治療中，效果明顯[2~4]。本研究采用電鏡和光鏡分別對(duì)新鮮和保存人羊膜的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，從形態(tài)學(xué)角度探討人羊膜超微結(jié)構(gòu)與眼表重建之間的關(guān)系。

1材料和方法

羊膜的取材、保存和解凍隨機(jī)選擇5例在我院產(chǎn)科接受剖宮產(chǎn)分娩的健康產(chǎn)婦，篩選條件為足月、產(chǎn)前母體血清學(xué)排除了HIV和HBV、HCV及梅毒。無(wú)菌條件下分別從剖腹產(chǎn)娩出的胎盤上取一塊胎膜組織，光滑面朝上，平鋪于無(wú)菌布巾上，用無(wú)齒鑷鈍性剝離并棄去絨毛膜，將羊膜片剪成1mm×2mm大小數(shù)塊，一半放入4%戊二醛溶液中固定并立即送電鏡和光鏡觀察。另一半置入無(wú)水甘油中脫水后，將其移入盛有無(wú)水甘油的滅菌小藥瓶中密封并置-80℃低溫冰箱中冷凍保存6個(gè)月。解凍時(shí)從-80℃低溫冰箱中取出，常溫下解凍后，在林格氏液中復(fù)水2次，每次約10分鐘，然后放入4%戊二醛溶液中送檢。

主要試劑進(jìn)口分裝戊二醛；英國(guó)JMC公司產(chǎn)鋨酸；乙醇和丙酮購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；進(jìn)口環(huán)氧樹酯812；上海新中化工廠產(chǎn)枸櫞酸鉛；進(jìn)口醋酸異戊酯。以上試劑均為分析純級(jí)。

主要儀器瑞典LKB-Ⅴ超薄切片機(jī)；日本電子公司JEM-100S型透射電鏡和JSM-T300型掃描電鏡，日本OlympusBX50光學(xué)顯微鏡。

實(shí)驗(yàn)方法采用透射電鏡、掃描電鏡和光鏡分別觀察新鮮人羊膜，6個(gè)月后同樣方法再觀察保存人羊膜。透射電鏡觀察：在4%戊二醛溶液中固定羊膜，采用磷酸鹽緩沖液沖洗，1%鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，100%丙酮浸透，環(huán)氧樹酯包埋、制片。將鋪于銅網(wǎng)上的切片經(jīng)枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾染色后，用透射電鏡觀察并照相；掃描電鏡觀察：繼上100%丙酮浸透后，改用100%醋酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥儀干燥，離子濺射儀真空噴金，用掃描電鏡觀察并照相；光鏡觀察：4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm切片，蘇木素—伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

2結(jié)果

透射電鏡觀察羊膜組織可分為5層，由內(nèi)向外依次為上皮細(xì)胞層、基底膜、致密層、纖維母細(xì)胞層和海綿層。新鮮人羊膜上皮細(xì)胞具有完整的細(xì)胞膜、豐富的細(xì)胞器和分泌顆粒、相鄰上皮細(xì)胞間以橋粒和緊密連接相連接，細(xì)胞表面有大量的微絨毛和微皺褶結(jié)構(gòu)。冷凍保存6個(gè)月后羊膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞核完整，細(xì)胞器與分泌顆粒及細(xì)胞間連接均與新鮮羊膜上皮細(xì)胞基本相似，僅頂面微絨毛和微皺褶結(jié)構(gòu)較保存前稍短。

掃描電鏡觀察新鮮人羊膜上皮細(xì)胞排列極其規(guī)則，其表面具有豐富的微絨毛，細(xì)胞間除有連接外，還有較多的微孔隙，保存6個(gè)月后羊膜上皮細(xì)胞形態(tài)仍極規(guī)則，其表面的微絨毛變得粗短、疏松，細(xì)胞間微孔隙加大，但相鄰細(xì)胞間連接仍存在。羊膜致密層和海綿層膠原纖維形成分子篩立體構(gòu)型。

光鏡觀察保存羊膜與新鮮羊膜均具有完整的立方上皮結(jié)構(gòu)，上皮細(xì)胞完整且形態(tài)規(guī)則，兩者基底膜完整。觀察5例，結(jié)果基本一致。

3討論

維持眼表上皮的穩(wěn)定是眼表重建成功的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新鮮人羊膜和低溫保存6個(gè)月的人羊膜均具有完整的上皮層，因而移植后可立即重建眼表上皮，防止膠原組織暴露，有效阻止膠原的溶解。臨床實(shí)踐證明，新鮮和保存人羊膜均可有效重建眼表上皮，且術(shù)后3個(gè)月左右羊膜上皮逐漸被受體眼結(jié)角膜上皮所替代[3,4]。

羊膜的保存時(shí)間，至今尚無(wú)定論。Dua等認(rèn)為，在-80℃低溫條件下保存的羊膜其上皮細(xì)胞已被滅活。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)透射電鏡和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，低溫條件下純甘油保存6個(gè)月的羊膜其上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞核完整，細(xì)胞器與分泌顆粒以及細(xì)胞間橋粒連接均與新鮮羊膜上皮細(xì)胞基本相似，其表面的微絨毛和微皺褶結(jié)構(gòu)仍在,并且不具有Kerr描述的細(xì)胞縮小變圓、失去原有形狀、微絨毛及細(xì)胞間連接消失、凋亡小體等細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)特征。從這種意義上說(shuō)，在-80℃低溫條件下純甘油中，人羊膜至少可保存6個(gè)月以上。

角膜上皮細(xì)胞可分3層，由內(nèi)向外依次為基底細(xì)胞、翼狀細(xì)胞、表面細(xì)胞。表面細(xì)胞分兩層，緊接淚膜的表面具有許多微絨毛和微皺褶,對(duì)角膜前淚膜的滯留起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人羊膜上皮細(xì)胞排列緊密、規(guī)則，且羊膜上皮細(xì)胞表面的微絨毛和微皺褶，對(duì)淚膜的滯留可能起著同樣的作用。

電鏡下羊膜分5層，且無(wú)血管、神經(jīng)及淋巴，這與以往的描述一致。羊膜本身就是一層生物透析膜，早期的羊水就是母體血清經(jīng)羊膜透析而成。本實(shí)驗(yàn)還觀察到，羊膜的上皮細(xì)胞層具有許多微孔隙，致密層和海綿層膠原纖維形成具有許多微孔隙的分子篩立體構(gòu)型。推測(cè)，小于孔隙的藥物分子將能通過(guò)羊膜到達(dá)羊膜下并蓄積，由此可提高藥物的局域濃度，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。同樣，角膜基質(zhì)內(nèi)過(guò)多的水分子也將由此排出，從而改善角膜大泡的癥狀，此可為羊膜移植治療大泡性角膜病變提供理論支持。這一過(guò)程究竟是主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，還是單純擴(kuò)散，還需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]KazuomiH,JunS,ShigetoS,etal.Multilayeredamnioticmembranetransplantationforsevereulcerationofthecorneaandsclera[J].AmJOphthalmol,2001,131(3):324-331.

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陳家祺,周世有,黃挺,等.新鮮羊膜移植治療嚴(yán)