p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼瘡樣小鼠腎組織的表達研究

p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼瘡樣小鼠腎組織的表達研究【摘要】目的：探討慢性移植物抗宿主病狼瘡樣小鼠腎組織p38MAPK的表達變化,進而分析p38MAPK在狼瘡腎炎腎纖維化發(fā)生中的作用。方法：將12只雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1雜交鼠隨機分為模型組及正常對照組,每組6只。于16周末處死，取腎行HE和Masson染色，應(yīng)用免疫組化方法檢測TGF-β1、p38MAPK、P-p38MAPK在腎臟的定位表達，RT-PCR法研究各組腎組織TGF-β1、p38MAPKmRNA的表達,Westernblot定量檢測TGF-β1、p38MAPK、P-p38MAPK蛋白的表達水平，并觀察兩組小鼠24h尿蛋白排泄量。結(jié)果：與正常對照組比較,模型組小鼠24h尿蛋白排泄量、TGF-β1、p38MAPK和P-p38MAPK蛋白及mRNA表達均明顯增加(P＜),TGF-β1與p38MAPK的表達呈正相關(guān)(r=,P＜)。結(jié)論：cGVHD狼瘡樣小鼠腎組織中TGF-β1、p38MAPK和P-p38MAPK蛋白及mRNA表達明顯上調(diào),p38MAPK信號通路可能在狼瘡腎炎腎纖維化的進程中起重要作用。

【關(guān)鍵詞】慢性移植物抗宿主??；狼瘡腎炎；p38MAPK；小鼠

狼瘡腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最重要的臨床表現(xiàn)之一，其病理改變以腎小球、血管、腎小管及其間質(zhì)損害為特征，最終急性或慢性進展為腎臟纖維化甚至腎功能衰竭。腎臟纖維化不僅是各型LN進展到終末期的共同病理表現(xiàn)，而且也是患者病情的重要反映指標(biāo)，在其發(fā)展過程中，多種因素發(fā)揮著重要作用,其中TGF-β1起著關(guān)鍵作用。有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)級聯(lián)是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),它參與胞外信號從表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)部的過程,為細胞內(nèi)信息傳遞的共同通路。近年來許多研究結(jié)果表明，其亞族p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但在LN腎纖維化的發(fā)生過程中是否起作用尚未見報道。因此本研究通過構(gòu)建慢性移植物抗宿主病(chronicgraftversushostdisease,cGVHD)狼瘡樣小鼠模型,探討作為TGF-β1下游信號介質(zhì)，p38MAPK在LN發(fā)展過程中的表達與活化及其可能的作用機制。

1材料與方法

實驗動物

8～10周齡雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1雜交鼠(以下稱雜交鼠)及6～7周齡DBA/2小鼠購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心,體重(±)g,SPF級，飼養(yǎng)于本校公共衛(wèi)生學(xué)院SPF動物房。

模型的建立與分組

［1］制作cGVHD狼瘡樣小鼠模型。按隨機、對照設(shè)計原則將12只雜交鼠分成模型組及正常對照組,每組6只。取DBA/2小鼠脾臟、胸腺、淋巴結(jié)細胞,制成單細胞懸液(約60%脾細胞、30%胸腺及10%淋巴結(jié)細胞),分別于0、3、7、10d經(jīng)尾靜脈注射于模型組雜交鼠,用臺盼藍染色和細胞計數(shù)板計數(shù),保證活細胞數(shù)大于95%,且每次給予細胞數(shù)為50×106個。正常對照組則于相應(yīng)時間經(jīng)尾靜脈注射等體積生理鹽水。兩組小鼠首次尾靜脈注射后每兩周留取1次24h尿,至16周處死動物，立即取下腎臟,一部分置于-70℃低溫保存,另一部分置于10%中性福爾馬林溶液中固定后行組織病理學(xué)檢查。

24h尿蛋白量測定

用雙縮脲比色法測定尿蛋白,小鼠尿液1∶5稀釋后按操作說明書操作。

RT-PCR

總RNA提取從-70℃低溫冰箱中取出腎組織,迅速用Trizol(晶美生物技術(shù)有限公司)勻漿提取總RNA。取5μl總RNA進行甲醛變性凝膠電泳,紫外燈下觀察5、18、28s條帶清晰提示RNA完整無降解。

逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下:在PCR管中加入10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1μl,MgCl2(25mmol·L-1)2μl,OligodT1μl,dNTPs(10mmol·L-1)2μl,RNaseinhibitorμl,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)1μl,總RNAμl,30℃10min后42℃逆轉(zhuǎn)錄50min,99℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5min,5℃5min,所得cDNA保存于-20℃用于PCR擴增。

PCR擴增TGF-β1、p38MAPK及GAPDH內(nèi)參照引物用DNAClub軟件設(shè)計,由上海英駿生物工程公司合成,序列如下:p38MAPK上游引物5′-tcgagaccgtttcagtccat-3′,下游引物5′-ccacggaccaaatatccact-3′,產(chǎn)物為463bp；TGF-β1上游引物5′-tgcttcagctccacagagaa-3′,下游引物5′-cttgcgacccacgtagtaga-3′,產(chǎn)物為267bp；GAPDH上游引物5′-acttgaagggtggagccaaa-3′,下游引物5′-ccaggaaatgagcttgaca-3′,產(chǎn)物為608bp。反應(yīng)體系:5×PCR緩沖液10μl,MgCl24μl,dNTPs1μl,上下游引物各1μl,cDNA模板1μl,TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)μl,補足雙蒸水至50μl。EppendorfAG22331PCR擴增儀擴增,p38MAPK條件為:94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s,54℃退火40s,72℃延伸1min,循環(huán)36次；72℃終末延伸10min。TGF-β1改退火溫度為56℃，其余與p38MAPK相同。

產(chǎn)物檢測擴增產(chǎn)物在含·L-1溴乙錠的1%瓊脂糖凝膠中以4～5V·cm-1電壓降電泳30min。于ImageMasterVDS凝膠掃描儀上成像,用TotallabV凝膠圖像分析軟件進行半定量分析。所有TGF-β1、p38MAPK擴增產(chǎn)物的吸光度均以GAPDH為基準(zhǔn)校正,以TGF-β1/GAPDH、p38MAPK/GAPDH表示。

病理檢查

2μm連續(xù)切片,置多聚賴氨酸包被的載玻片上,分別作HE和Masson染色，在普通光鏡下觀察各組小鼠腎組織病理變化。

免疫組化檢測

SABC法免疫組化染色(試劑盒購自晶美生物技術(shù)有限公司)：取2μm厚石蠟切片脫蠟至水；加3%過氧化氫溶液,室溫下孵育10min；滴加胃蛋白酶修復(fù)抗原,37℃孵育15min;加含10%羊血清的封閉液在室溫下封閉30min；滴加兔抗小鼠P-p38MAPK單克隆抗體(1∶100,CellSignalingTechnology公司),或兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗體(1∶100,CellSignalingTechnology公司)，或兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶100,SantaCruz公司)，4℃孵育過夜,37℃復(fù)溫30min；滴加生物素偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體,37℃孵育30min；加HRP標(biāo)記的鏈親和素,37℃孵育30min；DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹脂封片。陰性對照：以PBS替代一抗。

Westernblot

取-70℃保存的腎皮質(zhì)約100mg,加入預(yù)冷的蛋白裂解液ml充分裂解。4℃3000r·min-1離心10min取上清。測定蛋白質(zhì)含量，取100μg蛋白加入上樣緩沖液,煮沸3min后進行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)PVDF膜,TTBS封閉液37℃封閉2h,分別與兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗體和兔抗小鼠P-p38MAPK單克隆抗體,4℃過夜,加入1∶2500稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗,37℃,2h，DAB顯色。每組重復(fù)3次。Westernblot條帶信號強度應(yīng)用Kodak1D圖像分析軟件進行定量分析。目的條帶的相對含量=V目的條帶/V對照組。對照組的相對含量為，＞為表達陽性。

統(tǒng)計學(xué)處理

計數(shù)資料以x-±s表示,采用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析、t檢驗，相關(guān)性采用Spearman法分析，P＜為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

24h尿蛋白量測定結(jié)果

模型組小鼠24h尿蛋白總量為mg，顯著高于相應(yīng)正常對照組小鼠的mg，P＜。

腎組織p38MAPKmRNA、TGF-β1mRNA半定量結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果見圖1。模型組小鼠腎組織p38MAPK、TGF-β1mRNA表達分別與相應(yīng)正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜)，見表1。表1兩組小鼠腎組織p38MAPK、TGF-β1mRNA表達的半定量分析1)與正常對照組比較，P＜

腎組織HE、Masson染色結(jié)果

正常對照組小鼠腎小球、近端小管及遠端小管的大小、形態(tài)正常。模型組小鼠腎組織大多腎小球系膜細胞和內(nèi)皮細胞增生,系膜區(qū)增寬，大量基質(zhì)沉積,可見部分腎小球呈現(xiàn)萎縮硬化改變;腎小管呈多灶性萎縮及空泡變性,上皮細胞胞核脫落、壞死,管腔內(nèi)可見大量蛋白管型，腎間質(zhì)基質(zhì)沉積明顯。

免疫組化結(jié)果

腎組織中TGF-β1表達變化正常對照組小鼠僅在少數(shù)腎小管有微弱TGF-β1表達,而模型組小鼠腎小球細胞、腎小管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和腎間質(zhì)浸潤的單核細胞胞漿均有TGF-β1明顯表達，染色細胞數(shù)明顯增多，細胞染色程度加深。見圖2。

腎組織中p38MAPK表達變化正常對照組小鼠腎臟遠端腎小管、近端腎小管及集合管上皮細胞均有少量p38MAPK表達；模型組小鼠腎小球系膜區(qū)、內(nèi)皮細胞及臟層上皮細胞、腎小管間質(zhì)中陽性細胞數(shù)顯著增加，陽性表達顏色加深。見圖3。

腎組織中P-p38MAPK表達變化正常對照組小鼠僅腎小管間質(zhì)有極少量的P-p38MAPK表達；模型組小鼠腎組織P-p38MAPK主要表達在腎小球系膜區(qū)、內(nèi)皮細胞及臟層上皮細胞、近端和遠端腎小管及集合管上皮細胞。見圖4。

Westernblot檢測結(jié)果

Westernblot檢測結(jié)果見圖5。模型組小鼠腎組織TGF-β1、p38MAPK、P-p38MAPK蛋白表達較正常對照組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜)，見表2。表2兩組小鼠腎組織p38MAPK、TGF-β1和P-p38MAPK蛋白表達的定量分析

腎組織TGF-β1、p38MAPK和P-p38MAPK相關(guān)分析

實驗小鼠腎組織p38MAPK表達與TGF-β1表達呈正相關(guān)(r=,P＜)，P-p38MAPK表達與TGF-β1表達呈正相關(guān)(r=,P＜)，P-p38MAPK表達與p38MAPK表達呈正相關(guān)(r=,P＜)。

3討論

腎臟纖維化是幾乎所有腎臟疾病發(fā)展到終末期腎功能衰竭的共同通路,包括LN在內(nèi)許多進展性腎臟疾病均具有TGF-β1持續(xù)過度表達的特征。TGF-β1是公認的腎臟致纖維化因子之一,而MAPK通路是細胞內(nèi)TGF-β1信號通路的重要成分。其亞型p38MAPK是控制炎癥反應(yīng)最主要的MAPK家族成員之一,其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是近年來細胞生物學(xué)研究的熱點之一。p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路采用高度保守的三級激酶級聯(lián)傳遞信號:細胞外刺激激活MKKK(MAPkinasekinasekinase),轉(zhuǎn)而激活MKK(MAPkinasekinase),然后通過雙位點磷酸化成為磷酸化p38MAPK而激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與應(yīng)激條件下細胞的凋亡、免疫調(diào)節(jié)、細胞轉(zhuǎn)分化及炎癥反應(yīng)過程［2］。Meyer-Ter-Vehn等［3］研究表明，TGF-β1通過活化p38MAPK誘導(dǎo)人成纖維細胞膠原Ⅰ的合成，纖維連接蛋白(FN)、α-SMA的表達及細胞增殖,p38MAPK特異性抑制劑能抑制上述表達，說明p38MAPK在TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化及細胞外基質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。Stambe等［4］研究單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化動物模型中p38MAPK信號通路的作用時顯示，磷酸化p38MAPK在UUO大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞及腎小管上皮細胞均明顯增加，而以特定p38MAPK阻斷劑NPC31169處理UUO大鼠，則腎間質(zhì)纖維化程度明顯減輕，提示p38MAPK可能作為TGF-β1系統(tǒng)下游信號分子在腎間質(zhì)纖維化中起作用。Li等［5］通過構(gòu)建阿霉素腎病模型發(fā)現(xiàn)，p38MAPK和TGF-beta1/Smad2信號通路在該模型中相繼出現(xiàn)，而p38MAPK通路抑制劑SB203580及TGF-β1Ⅰ型受體ALK5抑制劑協(xié)同作用則可以降低肌成纖維細胞的積聚以及Ⅳ型膠原和FN的表達，進而阻礙腎小球硬化和間質(zhì)纖維化的進展。Niculescu等［6］對人近端腎小管上皮細胞HKC細胞株的研究則表明，TGF-β1誘導(dǎo)FN的生成是依賴于p38MAPK通路而非Smad通路。以上研究表明,p38MAPK確實參與了多種腎臟病腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展過程,是腎臟固有細胞重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。

但是,p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否與LN腎纖維化有關(guān),目前尚未見報道。LN為免疫復(fù)合物性腎炎,各種致病性自身抗體通過不同機制形成免疫復(fù)合物沉積于腎臟,誘發(fā)腎臟損害。cGVHD狼瘡小鼠是國際公認并被廣泛應(yīng)用的LN小鼠模型，其臨床和病理改變酷似人類Ⅳ型或Ⅴ型(WHO分型)LN,本實驗我們通過構(gòu)建該模型,從mRNA和蛋白質(zhì)兩個不同水平，觀察小鼠腎組織p38MAPK和TGF-β1的表達分布及表達量的變化。結(jié)果顯示,模型組小鼠24h尿蛋白量較正常對照組明顯升高,病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)腎小球硬化、基質(zhì)大量增生及間質(zhì)纖維化，這表明我們成功構(gòu)建了cGVHDLN小鼠模型。而且實驗結(jié)果表明,正常對照組小鼠的腎組織p38MAPK有一定的基礎(chǔ)表達,但其活化形式P-p38MAPK僅有極少量表達，模型組p38MAPKmRNA和蛋白表達明顯增多，同時P-p38MAPK表達亦相應(yīng)增加，與正常對照組相比具有顯著差異。另外，模型組TGF-β1表達明顯增加，且p38MAPK的表達強弱與腎組織TGF-β1的表達水平呈明顯正相關(guān)。這些結(jié)果提示,p38MAPK在cGVHD狼瘡樣小鼠模型發(fā)病中可能起重要作用,可能介導(dǎo)了腎組織TGF-β1的表達,從而促進腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。對于上述結(jié)果的可能解釋是：活化的TGF-β受體通過激活TGF-β活化蛋白激酶1(TAK1)和TAK1結(jié)合蛋白1(TAB1)(相當(dāng)于MAPKKK),啟動p38MAPK信號通路，發(fā)揮致腎臟纖維化的生物學(xué)效應(yīng)［7］；TGF-β1除激活p38MAPK通路外，還能激活Smad通路，p38MAPK與Smad兩條通路之間存在串話現(xiàn)象［8］，p38MAPK通路也可能通過與Smad通路的串話調(diào)節(jié)Smad介導(dǎo)的TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)；p38MAPK的激活能增強核轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB等的DNA結(jié)合能力,這些轉(zhuǎn)錄因子激活后可通過增加FN基因的轉(zhuǎn)錄活性,直接誘導(dǎo)FN的產(chǎn)生，同時提高TGF-β1mRNA的表達和Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，高表達的TGF-β1維持p38MAPK后期的持續(xù)活化，引起FN的持續(xù)累積，即p38MAPK在TGF-β1誘導(dǎo)FN聚積過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用；p38MAPK還可通過介導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)分化等作用，參與腎纖維化和腎功能進行性損傷的過程。

綜上所述，p38MAPK可能作為TGF-β1系統(tǒng)下游信號介質(zhì)，在LN的發(fā)病以及病變的進展過程中發(fā)揮重要作用。因此，抑制p38MAPK的活化及分泌有望成為阻止和延緩LN腎纖維化的一條較好途徑。

【參考文獻】

［1］任文英,陳香美,邱全瑛,等.慢性移植物抗宿主病狼瘡樣腎炎小鼠模型的誘導(dǎo)［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2004,14(4):215-222.

［2］YAOL,AKIRAN,YOUICHIA,etofmitogen-activatedproteinkinaseinrenalinjuryinducedbychronicaldosteroneinfusion［J］.ChinaJModernMed,2004,21(14):15-21.

［3］MEYER-TER-VEHNT,GEBHARDTS,SEBALDW,etinhibitorspreventTGF-beta-inducedmyofibroblasttransdifferentiationinhumantenonfibroblasts［J］.InvestOphthalmolVisSci,2006,47(4):1500-1509.

［4］STAMBEC,ATKINSRC,TESCHGH,etroleofp38alphamitogen-activatedproteinkinaseactivationinrenalfibrosis［J］.JAmSocNephrol,2004,15(2):370-379.

［5］LIJ,CAMPANALENV,LIANGRJ,etofp38mitogen-activatedprotein